Etude de la dépolarisation post potentiel

Pour les enregistrements en courant imposé dans les neurones vestibulaires primaires à E17, les potentiels d’action sont stimulés à partir de leur potentiel de repos (-55.0 ± 3.7 mV, n=34) en utilisant un saut de courant dépolarisant court (1.5 ms, 100 à 450 pA). La valeur du courant minimal nécessaire pour déclencher un PA ainsi que le seuil de celui-ci ne varient pas après application de 30 µM de Ni2+. Il est important de noter que dans nos conditions d’enregistrement, nous n’avons jamais observé de trains de potentiel d’action même lors de longues stimulations (10s).

POTENTIEL D’ACTION DEPOLARISATION

POST POTENTIEL Déclenchem ent (pA) Seuil d’activatio n (mV) Valeu r au pic (mV) 10-90% temps de croissanc e (ms) 10-90% temps de décroissance (ms) Largeur à mi- hauteur (ms) Valeu r au pic (mV) Temps de décroissanc e à mi hauteur (ms) Moyenne 248 -31.10 35.3 0.35 0.83 1.00 13.8 13.3 ± 35 2.24 6.1 0.15 0.20 0.28* 8.6 6.4 Contrôl e n 6 7 7 7 7 7 15 13 Moyenne 260 -31.17 33.8 0.34 0.83 0.98 ± 52 2.87 8.4 0.12 0.18 022* Ni2+ n 6 7 7 7 7 7

Tableau 4 : caractéristiques des potentiels d’action et de la dépolarisation post potentiel en condition contrôle et après application de 30 µM de Ni2+. Les données présentées incluent la moyenne, l’écart type et le nombre d’observations.

Pour 11 des neurones étudiés, après avoir enregistré les potentiels d’action, les neurones sont passés en mode potentiel imposé en présence de 300 nM de TTX, 60 mM de TEA et 5 mM de 4-AP dans le milieu extracellulaire afin de bloquer les conductances sodiques et de réduire les conductances potassiques, comme décrit précédemment (Chabbert et al., 1997 ; Chabbert et al., 2001b). Dans ces conditions de potentiel imposé, lorsque les enregistrements en courant imposé ont révélé la présence d’une ADP (Figure 14A), un grand courant de type T est observé (n=4) (figure 14b). Lorsque les neurones ne présentent pas d’ADP voire présentent une AHP, aucun courant de type T n’est enregistré (I = 60pA) (donnée non montrée). L’ajout de 30 µM de Ni2+ dans le milieu d’enregistrement réduit la composante ADP dans tous les neurones étudiés (n=13) (figure 14c)

Les caractéristiques des potentiels d’action hormis la partie ADP ne sont pas significativement différentes avant et après application de 30 µM de Ni2+ dans le milieu d’enregistrement lorsque l’ADP est présent (Tableau 4 et figure 14C).

L’application de 30 µM de Ni2+ sur des neurones présentant une AHP, n’a aucun effet sur le profil du potentiel d’action et sur la composante post potentiel (figure 14D). De plus, il est possible d’obtenir une réduction significative de la composante ADP en appliquant une perfusion rapide de milieu extracellulaire dans le bain (n=8, donnée non illustrée).

Figure 14 : Implication des courants calciques de type T dans la genèse de l’ADP. A : PA enregistré en mode courant imposé montrant un ADP (flèche) sur la phase de repolarisation. B : rampe de potentiel obtenue en potentiel imposé sur le même neurone après application de 300 nM de TTX, 60 mM de TEA et 5 mM de 4-AP afin de bloquer les courants sodiques et limiter les courants potassiques. Cette rampe révèle la présence d’un grand courant calcique de type T. Il est à noter un courant potassique résiduel dû à l’absence de Césium dans le milieu intra pipette. C : PA présentant un ADP (flèche) qui est bloqué par application de 10 µM de Ni2+. D : PA présentant une AHP qui est insensible à 30 µM de Ni2+.

Certains neurones enregistrés présentent un potentiel d’action sodique suivi d’un PA calcique (n=5) (figure 15A). Ces dépolarisations calciques ne sont pas affectées lors d’application de drogues bloquant la majorité des courants calciques à haut seuil d’activation fonctionnels dans les neurones vestibulaires primaires (Desmadryl et al.,

1997) (Chambard et al., 1999). Ces drogues sont l’ω-Conotoxine-GVIA (500 nM) et

l’ω-Agatoxine-IVA (300 nM) et bloquent respectivement les courants calciques de

type N, P/Q (figure 15B). Après blocage des conductances sodiques par ajout de 300 nM de TTX et réduction des courants potassiques par ajout de 60 mM de TEA et 5 mM de 4-AP dans le milieu extracellulaire, les enregistrements en potentiel imposé qui suivent l’enregistrement de PA calciques en courant imposé, montrent la présence d’un très grand courant calcique de type T (Figure 15C, I(T) ~ 1400 pA, pour

le neurone illustré). Le potentiel d’action calcique reste stable même après blocage du potentiel d’action sodique par ajout de 300 nM de TTX dans le milieu

extracellulaire. Celui-ci disparaît par ajout de 30 µM de Ni2+ dans le milieu

extracellulaire (figure 15C).

Figure 15 A : PA suivi d’un PA calcique. L’application de 500 nM d’ ω-Conotoxine- GVIA et de 300nM d’ω-Agatoxine-IVA pour bloquer respectivement les conductances N, P/Q, ne modifie pas l’amplitude du potentiel d’action calcique. B : Rampe de courant enregistrée dans le même neurone montrant un courant calcique de type T de grande amplitude après blocage des conductances sodiques et potassiques. Les courants calciques de type HVA restant révèle la présence de courants de type L et R, qui ont une mince contribution au courant calcique HVA global dans les neurones vestibulaires primaires. C : PA suivi d’un PA calcique. L’application de 300 nM de TTX élimine le PA sodique sans affecter le PA calcique qui est bloqué par application

Dans la première partie des résultats de ce manuscrit, nous avons mis en évidence que la sous-unité calcique de type T présente à la membrane du corps cellulaire du neurone à E17 et dans quelques neurones pour les stades néonataux était Cav3.2. De plus dans cette étude, nous avions mis en évidence que cette sous-

unité est sensible à la perfusion. Ainsi la sensibilité au Ni2+ et la sensibilité à la perfusion de la dépolarisation post potentiel dans les neurones vestibulaires primaires suggèrent fortement que cette composante du potentiel d’action correspond à l’activation de la sous-unité calcique Cav3.2.

Parallèlement à l’étude de la dépolarisation post potentiel, nous avons cherché à identifier la conductance à l’origine de l’épaulement lors de la phase de repolarisation du potentiel d’action.