Le sacrifice des animaux et le prélèvement des ganglions s’effectuent de la même manière que précédemment. Ce sont les techniques de dissociation qui vont être différentes. En effet, elles doivent être plus douces pour ne pas stresser les cellules et donc permettre leur survie et leur pousse en culture pendant plusieurs jours. Le milieu de culture utilisé est le même, c'est-à-dire du Neurobasal supplémenté avec du B27, glutamate et glutamine.
1) Traitement des boîtes pour la culture
Les boîtes utilisées pour la mise en culture seront des boîtes de 4 puits (Nunc), le diamètre des puits est de 14 mm. Une lamelle de verre stérilisée par un bain d’alcool absolu suivi d’un séchage à la flamme, sera déposée dans chacun des puits. Les lamelles sont détoxifiées en les laissant incuber 30 minutes dans du Neurobasal à 37°C et 5% CO2. Un premier traitement à la polyornithine est réalisé pendant une nuit, comme précédemment. La polyornithine est mise à sécher à température ambiante en ambiance stérile et un deuxième traitement utilisant la laminine, produite au laboratoire est alors réalisé. Cette laminine (10 mg/ml) est diluée dans du Neurobasal est déposée sur les lamelles d’une nuit à 15 jours avant la mise en culture.
2) Dissociation enzymatique
Les ganglions vestibulaires primaires en suspension dans 2 ml de PBS-Glucose, vont être dissociés en 2 temps. Dans un premier temps, 1 ml de PBS est retiré et remplacé par 1 ml Collagénase A (Roche). Cette dissociation s’effectue à 37°c et 5 % de CO2, pendant 10 min. Le milieu de dissociation est retiré et rincé 2 fois avec
900 µl de PBS sans calcium. Une deuxième dissociation enzymatique est alors réalisée à la suite, les ganglions sont mis en suspension dans 900 µl de PBS sans
calcium et 100 µl de trypsine (Gibco) pendant 10 minutes à 37°c et 5 % CO2. Ce
ajout de 100 µl de sérum de veau fœtal dans 900 µl de Neurobasal supplémenté, pendant 5 minutes à température ambiante.
Composition du PBS sans calcium utilisé : 10% de PBS sans calcium et magnésium 10X (Gibco).
3) Dissociation mécanique
Les ganglions sont repris dans 1 ml de Neurobasal supplémenté et 25 µl de Deoxyribonucléase 1 (Sigma). La dissociation enzymatique s’effectue à l’aide d’une pipette pasteur dont le diamètre est réduit à la flamme. Une série d’aspirations rejets est réalisée avec cette pipette jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas cellulaires visibles.
4) Comptage et ensemencement
Les neurones sont comptés à l’aide d’une cellule à Malassez à 2 champs. Tous les neurones présents sur le quadrillage sont recensés et une moyenne entre les deux champs est effectuée afin d’avoir le moins d’erreur possible. On ensemence en moyenne 3000 neurones par puits. La laminine est rincée trois fois à l’aide du Neurobasal supplémenté. 500 µl de neurones sont ensemencés par puits. En fonction du nombre de neurones dénombrés, du Neurobasal est ajouté et les facteurs neurotrophiques sont ajoutés : 1 µg/ml de BDNF, 1 µg/ml de NT3 et 2.10-5 M AraC (Sigma). La culture s’effectue alors à 37°c et 5 % de CO2.
Les cultures de neurones vestibulaires contiennent différents types cellulaires, l’utilisation de l’AraC, un antimitotique, permet l’élimination des cellules gliales par arrêt de leur prolifération. Les neurones sont repérables car rapidement des prolongements neuritiques poussent à partir du corps cellulaire.
D. TRANSFECTION DES NEURONES VESTIBULAIRES PRIMAIRES EN CULTURE
Les neurones sont transfectés avec des oligonucléotides antisens des ARNm des canaux calciques dépendants du voltage à bas seuil d’activation qui ont été caractérisés lors de la première partie de cette thèse. Ces oligonucléotides sont marqués avec un fluorochrome, la fluorescéine, afin de visualiser les cellules transfectées des autres. L’agent de transfection utilisé est un lipide cationique qui se complexe avec l’ADN et le transporte dans la cellule ainsi il facilite la pénétration de l’oligonucléotide dans les cellules. Il s’agit de la lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cette transfection est réalisée 4 heures après la mise en culture des neurones afin de leur permettre une bonne adhésion sur la lamelle de verre.
Lorsque la culture est suivie de transfection, le milieu de culture ne contient pas de glutamate. Ceci n’a pas d’incidence sur la survie et la pousse neuritique. D’autre part, les neurones sont toujours ensemencés sur 4 puits quelque soit le dénombrement. En effet le milieu de transfection et notamment la concentration des oligonucléotides et de la lipofectamine dépendent de la quantité de cellules recensées. Sachant la taille du puits et donc le volume final du mélange de transfection utile à la réalisation de celle-ci, les quantités d’ADN antisens et de lipofectamine ne dépendront que du nombre de cellules estimé par le comptage sur la cellule de Malassez.
Le volume de transfection utile est de 200 µl, la transfection de 100000 cellules nécessite 1 µg d’ADN antisens et 3 µl de lipofectamine.
Les oligonucléotides et la lipofectamine sont préparés séparément et incubés 5 min à T° ambiante puis mélangés et incubés 20 min à T° ambiante. Par la suite les mix de transfection sont mis dans les puits de culture après aspiration du milieu. La
transfection se fait à 37°c et 5 % de CO2 pendant 2h à 2h30. Le milieu de
transfection est remplacé par du milieu de culture (toujours sans glutamate) mais contenant les facteurs neurotrophiques. Lors de la réalisation des transfections, 4 conditions sont réalisées en même temps :
- Un puits contrôle, subissant les changements de milieu mais sans lipofectamine ni antisens
- Un puits ne contenant que de la lipofectamine permettant de vérifier qu’il n’y a pas d’effet de l’agent de transfection sur la pousse neuritique.
- Un puits ne contenant que l’antisens