Etude de l’échange H/D en spectrométrie de masse

L’échange hydrogène/deutérium (H/D) est une technique très utilisée en spectrométrie de masse pour déterminer la structure d’une protéine, identifier les sites de liaisons d’inhibiteurs de peptides ou protéines (Brier S. et al., 2006), étudier leurs changements de conformation dans différents solvants(Cai X. and Dass C., 2005) , proposer des mécanismes de fragmentation de métabolites (Liu D.Q. and Hop C.E.C.A., 2005) …

L’échange H/D peut être réalisé soit en utilisant un solvant deutéré lors de l’élution HPLC (Lacroix M. et al., 2007) ou de l’infusion avec une pompe à seringue (Cai X. and Dass C., 2005), soit avec un gaz isotopique (ND3 ou CH3OD) directement introduit dans la source

d’ionisation (Ustyuzhanin P. et al., 2001). Le taux d’échange des hydrogènes labiles dépend de l’environnement interne ou externe de la molécule. Ainsi les hydrogènes exposés vers le solvant ou le gaz deutéré peuvent être très rapidement échangés. La cinétique de l’échange est représentée par l’équation suivante :

kch = kint,A [ H+] + kint,B [OH-] + kint,e [H2O]

kch correspond au taux d’échange H/D et kint,A , kint,B et kint,W sont les constantes de

second ordre représentant respectivement les réactions intrinsèques de catalyse acide, basique et de l’eau. Cet échange dépend du pH ; la cinétique de l’échange atteint son minimum lorsque le pH est de l’ordre de 2-3 à température ambiante (Englander S.W., 2006).

A l’inverse, lorsque les hydrogènes des liaisons peptidiques sont impliqués dans des liaisons intramoléculaires ou protégés du solvant le taux d’échange est très lent. Il existe dans ce cas une compétition entre la cinétique de l’échange kch et la cinétique du

repliement de la molécule kcl avec cl pour l’anglais « reclosing ». Lorsque le repliement est

plus rapide que l’échange (kcl > kch), l’échange n’a lieu qu’au bout de plusieurs ouvertures

et fermetures successives de la molécule. La réaction d’ouverture, représenté par la constante kop avec op le terme « opening », entre alors dans l’équation de la cinétique

d’échange expérimentale (Kex) suivante :

Kex = kop kch / (kop + kcl + kch) ≈ Kopkch

L’approximation (kop/kcl = Kop < 1) permet de corréler l’énergie de l’ouverture de la

molécule ∆Gop avec le taux d’échange H/D expérimental (kex) et le taux d’échange

théorique (kch) selon la formule :

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La cinétique de l’échange des amides protégés est limitée par les paramètres thermodynamiques et cinétiques de la réaction de transition permettant l’ouverture de la molécule et exposant les hydrogènes vers le solvant(Englander S.W., 2006). Or ces paramètres d’ouverture des peptides dépendent majoritairement du pH et de la température. A pH basique et haute température les hydrogènes protégés peuvent être échangés rapidement et la cinétique de l’échange est très lente à pH acide et basse température.

Cai et ses collaborateurs ont caractérisé les structures des enképhalines dans l’oxyde de deutérium (D2O) et le trifluoroéthanol (TFE). Ils ont observé que le nombre

d’hydrogènes échangés dans ces peptides dépendait du solvant utilisé. Ils ont aussi démontré que quel que soit le solvant utilisé, le taux d’échange est très rapide (15 secondes) pour ces peptides et que le nombre d’hydrogène échangé dans la molécule n’augmentait pas au cours du temps (Cai X. and Dass C., 2005).

Afin de confirmer l’hypothèse que les deux pics, observés en spectrométrie de masse, correspondent à deux conformations différentes de la Leu-Enk et de déterminer ces conformations, des études sur l’échange H/D ont été réalisées sur la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT. L’eau et l’acide formique de l’éluant ont été remplacés par de l’oxyde de deutérium (D2O) et de l’acide formique d2 (DCOOD).

1) Etude MS de l’échange H/D

La Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT possèdent six protons échangeables dans sa structure plus un proton échangeable et ionisant lorsque la molécule est éluée avec D2O,

0,1% DCOOD (Figure 88). N S N N N N N O H O H O H O H HO OH O + H+

Figure 88: Représentation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et de ses protons labiles (en rouge)

133 Les spectres de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT obtenus avec l’élution deutérée présentent des massifs isotopiques différents pour chaque pic chromatographique.

Ces études H/D ont été répétées trois fois et les abondances relatives de chaque pic du spectre de masse avec leurs coefficients de variation sont répertoriées dans le Tableau 19.

Tableau 19 : Abondance relative de chaque pic des spectres de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT obtenus avec l'élution isotopique à tr= 9,04 min et tr = 10,00 min. Conditions de séparation : Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680,

Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : D2O, O,1% DCOOD/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20

= 20 % A. Détection spectrométrie de masse mode ESI+.

Tr = 9.04 min Tr = 10.00 min m/z Abondance relative % C V % (n = 3) Abondance relative % C V % (n = 3) 812 23.7 3.5 --- --- 813 57.9 6.8 6.6 1.3 814 100.0 --- 27.2 2.7 815 73.7 5.7 69.7 3.5 816 32.0 3.0 100.0 --- 817 14.5 2.3 74.6 4.6 818 --- --- 36.8 4.8 819 --- --- 13.2 1.3 820 --- --- 3.1 0.8

2) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 9,04 min

A tr = 9,04 min le spectre de masse obtenu présente un pic majoritaire (AR = 100%) à m/z = 814,5 ; cinq protons sur les sept possibles ont donc été échangés. Cette structure contient deux liaisons intramoléculaires ce qui corrèle avec la conformation β-Turn établie en modélisation moléculaire où deux liaisons hydrogènes sont impliquées (Figure 89).

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Figure 89 : Spectre de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr =9,04 min obtenus avec la phase mobile polaire D2O, O,1% DCOOD . Conditions de séparation : Colonne X-Bridge

Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min,

Elution : A : D2O, O,1% DCOOD/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A. Détection

spectrométrie de masse mode ESI+.

De plus, le spectre de masse présente un ion à m/z = 708,5 correspondant au fragment spécifique ayant perdu la chaîne aminothiol. Dans ce fragment quatre protons ont été échangés ; la perte de la molécule neutre contient un atome de deutérium qui correspond au proton de la fonction thiol de la molécule perdue. Ces résultats sont en accord avec le mécanisme de fragmentation proposé dans la Figure 85.

3) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 10,00 min

Le second pic chromatographique à tr = 10,00 min présente un pic majoritaire (AR = 100 %) à m/z = 816,5 sur le spectre de masse correspondant. L’ensemble des 7 protons labiles de la molécule a été échangé (Figure 90).

Rapport m/z A b o n d a n c e r e la ti v e %

135 Figure 90 : Spectre de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 10,00 min obtenu avec avec la phase mobile polaire D2O, O,1% DCOOD. Conditions de séparation : Colonne X-

Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3

mL/min, Elution : A : D2O, O,1% DCOOD/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A.

Détection spectrométrie de masse mode ESI+.

A tr = 10,00 min la molécule adopte une conformation linéaire et non la structure hélice 310 stabilisée par une liaison hydrogène. Il a été démontré que cette conformation

hélicoïdale n’est présente que dans les solvants aqueux et n’a pas été déterminée dans un mélange de solvants aqueux et organiques (Takekiyo T. et al., 2005).

Les études de modélisation moléculaires associées aux étude de l’échange H/D en spectrométrie de masse ont permis de confirmer l’hypothèse émise pour interpréter les deux pics de même rapport m/z = 809,6 correspondant à la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT pour une molécule injectée. La Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT s’ionise lors de l’élution acide sur deux sites de protonation, entraînant deux conformations stables avec des propriétés d’hydrophobie distinctes et donc séparable en HPLC.

Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Lacroix M. et al., 2007). Rapport m/z A b o n d a n c e r e la ti v e %

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