1 UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER
UFR PCA THESE
en vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier
Doctorat en CHIMIE :
Spécialité: CHIMIE MACROMOLECULAIRE ET SUPRAMOLECULAIRE Présentée et soutenue
par
Marlène LACROIX
Le 17 octobre 2007
O
PTIMISATION D
’
UNE METHODE DE DOSAGE DE NEUROTRANSMETTEURS
PAR LE COUPLAGE
LC/FLUO/MS.
E
TUDES THEORIQUES PAR
SPECTROMETRIE DE MASSE HAUTE RESOLUTION
,
MODELISATION
MOLECULAIRE ET
E
TUDE QUANTITATIVE
DE RELATIONS STRUCTURE
-
TEMPS DE RETENTION
(3D-QSRR)
Directeur de thèse : M. François COUDERCComposition du jury :
M. A. Lattes Professeur de l'U.P.S., Toulouse Président
M. L. Denoroy Directeur de recherche C.N.R.S, Lyon Rapporteur
M. E. Forest Chercheur C.E.A., Grenoble Rapporteur
M. L. Thion Docteur responsable d’unité Sanofi-Pasteur, Lyon Examinateur M. L. Debrauwer Ingénieur de recherche I.N.R.A., Toulouse Examinateur
M. F. Couderc Professeur de l'U.P.S, Toulouse Directeur de thèse
Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique (I.M.R.C.P.), UMR 5623, Université Paul Sabatier-Bât 2R1-118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex 9.
3
On fait la science avec des faits,
comme on fait une maison avec des
pierres : mais une accumulation de
faits n'est pas plus une science qu'un
tas de pierres n'est une maison.
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Remerciements…
Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse ont été réalisés au laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique (IMRCP) à l’Université Paul Sabatier de Toulouse. Je tiens à remercier les deux directrices qui se sont succédé : Isabelle Rico-Lattes et Monique Mauzac pour m’avoir accueillie dans ce laboratoire.
Je souhaite remercier M. Luc Denoroy et M. Eric Forest pour avoir pris le temps de corriger ce manuscrit de thèse, M. Laurent Thion et M. Laurent Debrauwer pour avoir accepté de participer à ce jury et pour leurs remarques pertinentes et M. Armand Lattes pour avoir présidé ce jury avec dynamisme et humour.
J’adresse mes remerciements à mon directeur de thèse François Couderc non seulement pour la confiance et la liberté qu’il m’a accordées mais aussi pour sa disponibilité et son soutien durant ces trois années de thèse. Vos explications en spectrométrie de masse et vos connaissances bibliographiques ont été un véritable atout pour la rédaction de ce manuscrit.
Toute ma reconnaissance et ma gratitude s’adresse à Jean-Christophe Garrigues qui a suivi de près ces travaux, de la première année de thèse à la rédaction.
Je te remercie pour ton humilité et tes discussions scientifiques et humaines. Une citation d’un écrivain espagnol Miguel de Unamuno décrit parfaitement le message que tu as voulu m’inculquer au cours de ces trois années : « La véritable science enseigne, par dessus tout, à douter et à être ignorant. ». Je souhaite de tout cœur avoir retenu cette leçon pour l’avenir.
Je tiens à remercier les membres de la société Waters pour leurs descriptions des colonnes chromatographiques, leurs conseils en HPLC et leur collaboration en spectrométrie de masse.
Je souhaite remercier Delphine et Georges pour leurs encouragements et surtout Laurence pour sa fraicheur. Ca a été un plaisir de travailler avec toi durant ton stage de Master2. Je remercie les autres membres de l’équipe de recherche « Spectrométrie de masse, fluorescence et bioanalytique » qui m’ont permis de prendre confiance en moi.
Un grand merci à toutes les personnes avec qui j’ai partagé un café, une tasse de thé ou une conversation et notamment Fernanda, Yann (uhuhuh) pour leur soutien quotidien. Non je ne t’ai pas oublié Richard, sacré gestionnaire, je tiens à te remercier pour ton amitié et tes conseils administratifs et quand tu veux on fait la course en crawl ! Un autre grand merci à la douce Elisabeth avec qui j’ai aussi partagé des longueurs de bassin et son fromage les midis !
Je remercie également Muriel Blanzat pour ces précieux conseils et ses stratégies au tarot ! Bien entendu il me serait impossible d’évoquer les fameuses parties de tarot sans citer ceux qui ont été mes co-équipiers ou mes adversaires mais néanmoins amis : Kamal, la belle Cristinich, Cosmin, Clém, Vinc…
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Romain, encore merci pour tes conseils en synthèse et pour ton soutien avec Tamara les derniers jours avant la soutenance.
Bien sûr je remercie Kouky et Elo di Soussa (Elodie Soussan) pour leur amitié et leur confiance. Vous étiez toujours présentes dans les bons moments comme dans les mauvais telles de véritables amies.
C’est avec les larmes aux yeux que je remercie ma famille qui me soutient depuis toujours, mes amis de Limoges et Bab qui m’a accompagné dans cette aventure. Je vous dédicace ce manuscrit avec toute la ferveur que j’ai mis pour le rédiger. Le philosophe Alain a écrit : « Aimer, c’est trouver sa richesse hors de soi. », je vous le confirme, je possède un fabuleux trésor. ENCORE MERCI !!!
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Résumé :
Certains acides aminés et peptides sont des neurotransmetteurs impliqués dans les maladies neurologiques. Présents en très faible quantité dans les échantillons biologiques, une HPLC couplée à un détecteur de fluorescence et un spectromètre de masse est utilisée pour identifier et doser ces molécules. Les acides aminés sont marqués avec un agent fluorogène : le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) et un nucléophile (CN-). Pour
l’analyse des peptides enképhalines, le marquage est modifié afin de faciliter l’analyse en spectrométrie de masse : le nucléophile CN- est remplacé par un aminothiol facilement
ionisable en mode positif, le N,N-diméthylaminoéthanethiol (MeAT). Des études théoriques en modélisation moléculaire, spectrométrie de masse haute résolution et sur l’échange H/D ont été réalisées pour interpréter les résultats obtenus avec chaque marquage.
Mots Clés : HPLC, Spectrométrie de masse, Détection de fluorescence, NDA, Acides aminés, Enképhalines
Abstract:
Some amino acids and peptides are neurotransmitters involved in neurological diseases. As they are very low concentration in biological samples, HPLC coupled with a fluorescence detector and a mass spectrometer is performed for the identification and the quantification of these molecules. As amino acids are not fluorescent natively, they are labelled with a fluorogenic dye: the naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA) and a nucleophile (CN-). The labelling for the peptides (enkephalins) is slightly modified in order
to facilitate the ionisation in positive mode in mass spectrometry: the nucleophile CN- is
substituted by an aminothiol easily ionisable, the N,N-dimethylaminoethanethiol (MeAT). Some theoretical studies are investigated in molecular modelling, high resolution mass spectrometry and H/D exchange studies in order to explain the results obtained on each labelling.
Keywords: HPLC, Mass spectrometry, Fluorescence detection, NDA, Amino acids, Enképhalins
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Sommaire
Introduction générale ... 15
Mise au point bibliographique ... 19
Chapitre 1. Le système nerveux à l’échelle moléculaire : les neurotransmetteurs .. 21
A. Généralité ... 21
I. Définitions ... 21
1) Neurotransmetteurs ... 21
2) Neuromodulateurs et neurohormones ... 22
II. Exemples de neurotransmetteurs ... 23
1) La dopamine ... 23
2) La noradrénaline ... 24
3) L’aspartate et le glutamate ... 25
4) L’acide gamma-amino-butyrique ... 26
5) Les enképhalines ... 26
B. Préparation des échantillons ... 29
I. Les prélèvements biologiques ... 29
II. La perfusion de type push-pull ... 30
1) La perfusion classique ... 30
2) Le système push-pull à faible débit ... 30
III. La microdialyse ... 31
1) Principe ... 31
2) Applications ... 32
3) Avantages et limites de la microdialyse ... 33
IV. Conclusions ... 33
C. Méthodes d’analyse et de quantification ... 35
I. Les méthodes immunochimiques ... 35
II. Les techniques électrochimiques ... 36
III. Les techniques séparatives ... 37
1) Electrophorèse capillaire ... 37
2) Chromatographie liquide à haute performance ... 39
3) Modes de détections ... 43
IV. La spectrométrie de masse ... 47
1) Historique ... 47
2) Principe ... 48
3) Les sources d’ionisation ... 48
4) Les analyseurs ... 51
5) La spectrométrie de masse tandem : MS/MS ... 55
Résultats ... 59
Chapitre 2. Analyse de neurotransmetteurs de types acides aminés ... 61
A. Rappels sur les méthodes de marquage des acides aminés. ... 61
B. Etude du marquage des acides aminés avec le système NDA/CN-. ... 65
I. Etude spectroscopique du NDA et des dérivés benzisoindoles ... 65
II. Cinétique de marquage des dérivés benzisoindoles ... 66
C. Mise au point chromatographique ... 68
I. Séparation des acides aminés et des amines biogènes ... 68
1) Grandeurs caractéristiques ... 68
2) Choix de l’éluant ... 69
3) Essai de séparation ... 70
II. Optimisation de la séparation chromatographique ... 72
1) Séparation sur différentes colonnes ... 72
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III. Etude en spectrométrie de masse... 79
1) Etude en mode positif ... 79
2) Etude en mode négatif ... 80
IV. Automatisation du marquage dans la boucle d’injection ... 82
1) Optimisation du rapport NDA/CN- ... 83
2) Optimisation du temps de réaction ... 84
3) Séparation des 20 amines marquées ... 85
4) Limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ... 87
5) Etude d’échantillons biologiques ... 88
6) Conclusions ... 91
Chapitre 3. Nouvelle méthode de marquage pour l’analyse des Enképhalines ... 95
A. Essai avec le système NDA/CN-. ... 95
I. Etudes spectroscopiques ... 95
II. Etude en spectrométrie de masse ... 96
B. Nouvelle méthode de marquage des peptides ... 98
I. Etudes spectroscopiques ... 98
II. Etudes en spectrométrie de masse ... 100
III. Comparatif des différents marquages ... 101
IV. Etude LC/LIF/MS ... 101
1) Séparation des enképhalines ... 102
2) Limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ... 104
V. Automatisation du marquage ... 105
1) mise au point des conditions de marquage. ... 105
2) limite de détection et de quantification ... 107
3) Etude d’un échantillon biologique ... 108
4) Conclusions ... 109
C. Nouvelle méthode de quantification en spectrométrie de masse ... 110
I. Principe ... 110
II. Etude en infusion directe ... 111
III. Etude par le couplage LC/LIF/MS ... 112
Chapitre 4. Etudes théoriques ... 117
A. Etude des conformations de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ... 117
I. Etude de spectrométrie de masse des ions isobares des enképhalines marquée avec NDA/MeAT. ... 118
1) Mesure de la masse exacte. ... 118
2) Etude de l’abondance isotopique de chaque composé. ... 119
3) Etude de fragmentation MS/MS ... 120
II. Modélisation moléculaire ... 125
1) Localisation des sites de protonation. ... 125
2) Etudes des conformations de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT en fonction du site de protonation. ... 127
III. Etude de l’échange H/D en spectrométrie de masse... 131
1) Etude MS de l’échange H/D ... 132
2) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 9,04 min ... 133
3) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 10,00 min ... 134
B. Etude quantitative des relations structure-temps de rétention (QSRR). ... 136
I. Principe des études QSAR, QSPR, QSRR ... 136
II. Les descripteurs moléculaires ... 137
1) Les descripteurs physico-chimiques ... 137
2) Les descripteurs électroniques ... 138
3) Les descripteurs topologiques ... 138
III. Les réseaux de neurones artificiels. ... 140
1) Historique ... 140
13
3) Algorithme de rétropropagation ... 142
IV. Méthode d’élaboration d’un réseau de neurone ... 143
V. Résultats ... 144
1) Détermination des descripteurs essentiels ... 144
2) Construction des réseaux de neurones prédictifs ... 147
3) Application de l’étude QSRR à l’arginine ... 151
Conclusion générale ... 153
Partie Expérimentale ... 157
A. Liste des produits chimiques : ... 159
B. Protocole de marquage ... 160
I. Marquage manuel ... 160
1) Préparation des solutions ... 160
2) Marquage des amines primaires ... 160
II. Marquage automatisé dans la boucle d’injection ... 161
1) Préparation des solutions ... 161
2) Protocole de marquage ... 161
3) Etude des rapports NDA/CN- et NDA/MeAT et des durées d’incubation ... 161
C. Etudes spectrométriques du marquage ... 162
I. Etudes en UV-visible ... 162
II. Etudes en fluorescence ... 162
D. Conditions chromatographiques ... 162
I. Appareillage ... 162
1) Chaîne HPLC ... 162
2) Paramétrage des détecteurs ... 163
3) Préparation des solvants et des échantillons ... 163
II. Séparation des acides aminés et amines biogènes marqués avec NDA/CN- .... 164
1) Séparation sur colonnes X-Terra RP18 (250 x 4,6 mm ; 5 µm) ... 164
2) Séparation sur colonne monolithe RP 18e β-test (3 x 100 mm) ... 165
3) Séparation sur colonne X-Bridge Shield RP18 (2,1 x 100 mm, 3.5 µm) ... 165
III. Séparation des enképhalines marquées avec NDA/MeAT ... 166
IV. Calcul des limites de détection et de quantification ... 166
V. Etudes de l’échange hydrogène/deutérium ... 166
E. Conditions en spectrométrie de masse ... 167
I. Paramétrage ... 167
II. Etalonnage de l’appareil ... 167
III. Mesure en injection directe ... 167
IV. Mesure en couplage LC/MS ... 167
V. Mesure de la masse exacte de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ... 168
VI. Mesure de l’abondance isotopique relative de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ... 168
F. Modélisation moléculaire ... 168
I. Modélisation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ... 168
II. Modélisation des acides aminés marqués avec NDA/CN- pour l’étude QSRR ... 169
15
17 Le cerveau est l’organe le plus complexe du corps humain. Il permet d’établir, de coordonner, de diffuser les informations et de contrôler notre raisonnement, notre comportement et nos émotions. Cet organe est comparable à un vaste réseau de communication et la rupture d’une de ses branches peut entraîner des anomalies du fonctionnement et des troubles mentaux.
De nos jours, en France, 1 homme sur 10 et 1 femme sur 5 souffriront de dépression au cours de sa vie, 500000 cas d’épilepsie ont été recensés et les schizophrènes représentent 1% de la population.
A ces troubles, il faut ajouter les maladies issues de la dégénérescence des neurones telles que la maladie d’Alzheimer et de Parkinson dont 900000 et 120000 personnes sont atteintes, ce qui représente environ 7 % des personnes âgées de plus 60 ans.
Ces maladies constituent un redoutable défi pour notre société vieillissante au rythme de vie très soutenu. Les troubles neurologiques du fait de l’allongement de l’espérance de vie, constitueront la première cause de mortalité en France.
De nombreuses activités de recherche ont été développées dans le monde pour comprendre ces maladies et les combattre. Le gouvernement, par exemple, a mis en place en 2004 un « plan maladie d’Alzheimer et maladies apparentées » articulé en 10 objectifs (source : http://www.sante.gouv.fr). Ces travaux ont démontré que ces troubles neurologiques sont en partie associés à un excès ou une carence de certaines molécules du système nerveux : les neurotransmetteurs.
Comprendre les mécanismes d’action et l’altération de ces molécules chez les personnes atteintes de problèmes cérébraux est essentiel pour élaborer de nouveaux traitements et améliorer les méthodes de prévention et de dépistage de ces affections.
Il est donc primordial de pouvoir doser dans les échantillons biologiques les neurotransmetteurs. Ces dosages nécessitent le développement et l’utilisation de technologies très sensibles, ayant la capacité de quantifier à l’ordre du nanomolaire.
L’objectif des travaux présentés est d’optimiser une nouvelle méthode de dosage des neurotransmetteurs dans des échantillons biologiques en développant un marquage des neurotransmetteurs avec un agent de fluorescence, le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) et en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) couplée à la détection de fluorescence et à la spectrométrie de masse (SM) comme technique analytique. Ces travaux s’articuleront en cinq chapitres.
Le premier chapitre introductif est un rappel bibliographique définissant le terme de « neurotransmetteur » et leurs implications dans les maladies biologiques. Les
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différentes techniques d’échantillonnage de ces molécules seront exposées ainsi que les différentes méthodes utilisées pour les analyser avec une brève description de la HPLC et de la spectrométrie de masse.
Le second chapitre est consacré à la mise au point d’une méthode d’analyse des neurotransmetteurs de type acides aminés en HPLC et fluorescence avec l’étude du NDA. Ce chapitre est finalisé par le développement d’un marquage automatisé et l’étude d’échantillons biologiques.
Dans le troisième chapitre nous nous sommes intéressés à l’analyse de molécules plus complexes : les enképhalines. Pour ce faire, le marquage utilisé dans le deuxième chapitre a été adapté à l’étude de ces peptides pour être à la fois compatible à la détection de fluorescence et à la spectrométrie de masse.
Le quatrième chapitre est une interprétation théorique des résultats obtenus dans les deux chapitres précédents. Une première partie propose une étude approfondie en spectrométrie de masse accompagnée de la modélisation moléculaire pour analyser un phénomène particulier observé lors de l’élution des enképhalines marquées avec le couplage HPLC/MS. La seconde partie est une étude quantitative de relations structure temps de rétention (QSRR) fondée sur la modélisation moléculaire et l’utilisation de réseaux de neurones artificiels. Ces outils informatiques permettront d’établir des comparaisons entre les colonnes chromatographiques utilisées lors de la séparation des acides aminés.
Enfin, après une conclusion générale sur l’ensemble de ces travaux, le dernier chapitre regroupera toutes les données expérimentales utilisées au cours de ces travaux de thèse.
19
21
Chapitre 1.
Le système nerveux à l’échelle moléculaire : les
neurotransmetteurs
A.
Généralité
Le système nerveux est constitué de réseaux de neurones à travers lesquels circule l’influx nerveux. A la fin du XIXème siècle, Cajal (Cajal S.R., 1894) affirme que le neurone
est une entité anatomique c’est-à-dire qu’il existe une contiguïté entre les neurones et non une continuité. Apparaît alors le terme de synapse désignant la zone où a lieu la jonction d’un neurone à un autre (Figure 1). La transmission d’informations d’un neurone dit présynaptique à un second (postsynaptique) est assurée par des substances chimiques appelées, neurotransmetteurs (NT). Ces neurotransmetteurs sont véhiculés par exocytose des vésicules et captés par les récepteurs membranaires du neurone postsynaptique.
Figure 1 : Mécanisme de la transmission de l’influx nerveux
I.
Définitions
1) Neurotransmetteurs
En 1936 Dale et Loewi obtiennent le Prix Nobel de Physiologie et de Médecine pour leurs travaux sur la transmission chimique. Ils isolent le premier neurotransmetteur : l’acétylcholine et établissent à partir de son étude, les conditions requises pour entrer dans cette catégorie de molécule.
22
Les neurotransmetteurs doivent être localisés dans les neurones du système nerveux central, formé par le cerveau et la moelle épinière, avec une distribution régionale caractéristique. Ils doivent être concentrés dans l’élément présynaptique ainsi que son système de biosynthèse. Ces derniers sont libérés lors d’une stimulation présynaptique et présentent une identité physiologique et pharmacologique qui leur est propre. L’action du neurotransmetteur doit être très fugace ce qui nécessite la présence d’un système d’inactivation soit enzymatique, soit physicochimique qui arrête très rapidement son action. A ces critères se sont ajoutés avec l’évolution des moyens de reconnaissance, la mise en évidence de récepteurs spécifiques et l’obtention d’un changement de perméabilité ionique de la membrane postsynaptique (Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995).
De nombreuses études ont progressivement démontré que certaines amines biogènes, acides aminés et peptides répondaient à ces conditions ou jouaient un rôle important dans la neurotransmission.
2) Neuromodulateurs et neurohormones
Vue la quantité de molécules ayant une action sur la médiation de l’information, les notions de neuromodulateurs et de neurohormones ont été introduites afin d’élargir le domaine strict de la neurotransmission.
Un neuromodulateur est par définition un messager chimique d’origine neuronale qui ne vérifie pas un des critères cités précédemment. Il ne peut pas agir seul mais il est capable de modifier l’action du neurotransmetteur en agissant sur des récepteurs postsynaptiques spécifiques(Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995).
Les neurohormones sont quant à elles des substances chimiques qui cumulent certaines propriétés des transmetteurs et des hormones.
Chaque substance chimique n’appartenant pas nécessairement à une de ces définitions mais pouvant occuper plusieurs de ces fonctions, le terme de « neuromédiateur » regroupe l’ensemble de ces catégories de molécules.
23
II.
Exemples de neurotransmetteurs
Un grand nombre de molécules a été identifié comme neurotransmetteur, dans les différentes régions du cerveau représentées dans la Figure 2.
Figure 2 : Coupe d'un cerveau humain et représentation de ses différentes régions.
Dans ce paragraphe seuls les systèmes faisant l’objet de nos travaux seront brièvement décrits.
1) La dopamine
La dopamine est une catécholamine qui, avant les travaux de Carlsson (Carlsson A. et al., 1957), était considérée seulement comme un intermédiaire métabolique de la synthèse de la noradrénaline.
Cette catécholamine ne franchit pas la barrière hémato-encéphalique, son métabolisme commence par la capture de la phénylalanine (Phe) et de la tyrosine (Tyr), ses précurseurs, au niveau des terminaisons neuronales. La phénylalanine est hydroxylée par la phénylalanine hydroxylase (PH) et devient de la tyrosine. Cette molécule est transformée en dihydroxyphénylalanine (DOPA) grâce à l’enzyme catalytique : tyrosine hydroxylase (TH). La DOPA subit ensuite une décarboxylation par la DOPA décarboxylase (DDC) pour former la dopamine (Figure 3).
Les neurones dopaminergiques représentent plusieurs millions sur les dix milliards de neurones du système nerveux central (SNC) et sont surtout présents dans la partie mésencéphalique du SNC (Figure 2). La transmission de la dopamine entre les neurones
24
participe à de nombreuses fonctions dans ce système. Un excès ou un défaut de concentration en dopamine entraîne de nombreuses pathologies. En effet, une hyperactivité des transmissions de dopamine augmente la concentration de ce neurotransmetteur dans la fente synaptique. Cet excès est alors associé à des troubles décrits dans l’anorexie mentale ou la schizophrénie (agitation, délire, hallucination…)(Perez-Neri I. et al., 2006). A l’opposé, un défaut de transmission de dopamine a pour conséquence certains états dépressifs, la maladie de Parkinson (destruction des neurones dopaminergiques)(Lemke M.R. et al., 2004), des démences de type Alzheimer (perte de la mémoire, manque d’attention)(Cropley V.L. et al., 2006).
2) La noradrénaline
La noradrénaline est avec l’adrénaline un des plus anciens neurotransmetteurs identifiés. Au départ, cette catécholamine n’était considérée que comme un intermédiaire de la réaction de synthèse de l’adrénaline. C’est dans les années 40 qu’Euler démontre son rôle de neuromodulateur dans les neurones (Von Euler U.S. et al., 1949) et Vogt le caractérise en 1954 comme neurotransmetteur à part entière dans le système nerveux central alors que l’adrénaline est définie comme neuromodulateur(Vogt M., 1954).
Cette molécule présente la même voie de synthèse que la dopamine qui subit une hydroxylation dans les vésicules synaptiques catalysée par la Dopamine-β-hydroxylase (DBH) (Figure 3).
Phe
Tyr DOPA DOP NOR
NH2 HOOC NH2 HOOC OH NH2 HOOC OH OH NH2 OH OH OH PH TH DDC DBH NH2 OH OH PH : phénylalanine hydroxylase TH : tyrosine hydroxylase DDC : DOPA décarboxylase DBH : dopamine-β-hydroxylase
Figure 3 : Métabolisme de la dopamine et de la noradrénaline
Dans le système nerveux central, la noradrénaline est principalement localisée dans les régions du pont et du bulbe du tronc cérébral (Figure 2). Un déficit de transmission de la noradrénaline dans ces deux régions du cerveau est à l’origine des troubles de deux maladies neurodégénératives (maladie due à la détérioration des neurones) chez l’Homme
25 (les maladies de Parkinson et d’Alzheimer) mais aussi la schizophrénie(Yamamoto K. and Hornykiewicz O., 2004).
3) L’aspartate et le glutamate
Les acides glutamiques (Glu) et aspartiques (Asp) sont des acides aminés naturels présentant une fonction acide carboxylique sur la chaîne latérale ; ces molécules neutres sont en équilibre avec leurs formes zwittérioniques (Figure 4). Dans le système nerveux (à pH ≈ 7-8), les acides glutamiques et aspartiques sont présents sous leurs formes anioniques. Ces molécules peuvent augmenter l’activité des neurones ; elles sont qualifiées d’acides aminés excitateurs (AAE). Curtis et ses collaborateurs (Curtis D.R. et al., 1959) ont été les premiers à proposer ces acides aminés comme neurotransmetteurs en 1959. Ces deux molécules présentant des structures et des propriétés très voisines, activent les mêmes récepteurs.
Glu HOOC COOH NH2 Asp HOOC COOH NH2 Asp HOOC COO -NH3+ Glu HOOC COO -NH3+ Aspartate -OOC COO -NH3+ Glutamate -OOC COO -NH3+
Figure 4 : Formules développées des acides glutamiques et aspartiques sous leurs formes neutres, zwitterioniques et anioniques
Ne franchissant pas la barrière hémato-encéphalique, ils sont synthétisés dans les terminaisons nerveuses. Le glutamate peut être obtenu à partir du glucose via le cycle de Krebs, par la transamination de l’acide α-céto-glutarique ou par désamination de la glutamine (Gln). L’aspartate a plusieurs origines : l’oxaloacetate, l’asparagine (Asn) mais aussi le glutamate et la glutamine.
Ces acides aminés excitateurs sont largement distribués dans le système nerveux central au niveau du télencéphale et principalement dans le système limbique. On les retrouve aussi dans quelques régions de l’hippocampe, du noyau caudé-putamen, latéral et baso-latéral (Figure 2).
Un dysfonctionnement de la neurotransmission glutamatergique (et aspartatergique) est impliqué dans les maladies épileptiques mais aussi dans les troubles psychiatriques tels que la schizophrénie(Perez-Neri I. et al., 2006).
26
4) L’acide gamma-amino-butyrique
L’acide γ-amino-butyrique (GABA) est l’un des neurotransmetteurs les plus répandus dans le système nerveux central. Il intervient dans environ 30% des synapses centrales chez les vertébrés. Il présente des propriétés inhibitrices, contrairement aux acides aminés excitateurs il diminue l’activité nerveuse des neurones.
C’est un acide aminé de la série oméga constitué de 4 atomes de carbone et spécifique du tissu nerveux (Figure 5).
HOOC NH2
GABA
Figure 5 : Formules développées de l'acide gama-amino-butyrique
Le précurseur du GABA est la glutamine ; cet acide aminé est transformé en acide glutamique par la glutaminase puis décarboxylé par la GAD (glutamic acid decarboxylase).
Ce neurotransmetteur est principalement localisé dans le striatum (95% des cellules) mais aussi au niveau du cortex cérébral, de l’hippocampe ou du thalamus (Figure 2). De fortes densités en terminaisons GABAergiques sont à noter dans la substance noire réticulée (SNR) et le globus pallidus(Chen L. and Yung W.H., 2004).
Une déficience de transmission de ce neurotransmetteur est epileptogène, en effet, une réduction du taux de GABA favorise l’apparition des convulsions épileptiques(Cossart R. et al., 2005). A l’extrême une augmentation de la transmission GABAergique peut présenter des effets sédatifs. De plus, une altération du métabolisme cérébral du GABA peut être associée à des troubles neurologiques tels que la chorée de Huntington ou la maladie de Parkinson (Chen L. and Yung W.H., 2004; Epelbaum J., 1995).
5) Les enképhalines
Les enképhalines sont des peptides appartenant à la famille des opiacés. Hughes et ses collaborateurs identifièrent en 1975 dans le cerveau de porc deux pentapeptides ; la leucine–enképhaline (Leu-Enk) et la méthionine-enképhaline (Met-Enk)(Figure 6)(Hughes J. et al., 1975). Ces deux molécules présentent les mêmes propriétés antinociceptives (atténuation ou suppression des sensations douloureuses) que la morphine car elles se fixent sur les mêmes récepteurs opiacés. En effet les enképhalines, qui présentent des structures différentes de celles des morphines classiques, adoptent dans l’espace des conformations similaires(Gacel G. et al., 1979).
27 H2N N N N N HO O H O H O H O H S O OH H2N N N N N HO O H O H O H O H O OH Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Leu-Enk Met-Enk
Figure 6 : Formules développées de la Méthionine-enképhaline et de la Leucine-enképhaline Dans le système nerveux central, les enképhalines sont issues de la protéolyse d’un précurseur de haut poids moléculaire : la proenképhaline constituée de 243 acides aminés. Elles sont distribuées de manières très hétérogènes dans le système nerveux central. Les régions les plus concentrées sont le globus pallidus, le caudé-putamen, l’amygdale et l’hypothalamus (Figure 2).
Outre les propriétés analgésiques de ces molécules, les enképhalines sont capables de diminuer la vitesse de renouvellement de la noradrénaline et d’augmenter celle de la dopamine. De part ces interactions, ces molécules sont impliquées indirectement dans les pathologies neurologiques comme la maladie de Parkinson, d’Alzheimer, la schizophrénie ou la dépression(Diez M. et al., 2003; Yew D.T. et al., 1999).
28
Toutes les molécules étudiées dans les chapitres suivants sont résumées dans le tableau ci-dessous :
Tableau 1 : Récapitulatif des neurotransmetteurs étudiés dans les chapitres suivants.
Nom Abrév. Formule développée Localisation Maladies liées
Dopamine Dop NH2 HO HO Mésencéphale Schizophrénie Alzheimer Parkinson Dépression Noradrénaline Nor NH2 HO HO OH
Rhombencéphale Schizophrénie Alzheimer Parkinson Acide Aspartique Asp HOOC COOH NH2 Prosencéphale Schizophrénie Epilepsie Acide Glutamique Glu HOOC COOH NH2 Acide gamma-aminobutyrique GABA HOOC NH2 Prosencéphale Chorée de Huntington Epilepsie Parkinson Leucine-Enképhaline Leu-Enk Prosencéphale Schizophrénie Alzheimer Parkinson Dépression Méthionine-Enképhaline Met-Enk
29
B.
Préparation des échantillons
Le dosage de neurotransmetteurs dans les organismes vivants est fondamental pour comprendre le métabolisme de ces molécules lors de dysfonctionnement de la neurotransmission ou pour observer les effets pharmacologiques d’un médicament. Pour cela, différentes méthodes d’échantillonnage ont été établies afin d’analyser ces composés.
I.
Les prélèvements biologiques
Dans le cerveau, des fragments de structure cérébrale ou des échantillons liquides peuvent être prélevés post-mortem ou in vivo. En effet, le cerveau baigne dans un liquide dit cérébrospinal (LCS) ou céphalo-rachidien (LCR). Chez l’Homme ce liquide, d’environ 150 mL de volume, est renouvelé quatre fois par jour en moyenne. Il est donc possible d’en prélever quelques millilitres sur des sujets vivants au moyen d’une ponction lombaire.
Vu la complexité moléculaire de ces échantillons, il est nécessaire d’établir des protocoles d’extraction précis pour analyser les neurotransmetteurs dans des conditions expérimentales reproductibles.
Les neurotransmetteurs sont généralement extraits des composés de haut poids moléculaire (protéines et peptides) par la technique de précipitation et de centrifugation puis séparés des sels sur des cartouches d’extraction de phases solides (cartouches SPE)(Shah A.J. et al., 2002). Ces méthodes peuvent être appliquées à différents types de liquides biologiques (salive, urine, plasma…) et toutes sortes de tissus cellulaires (organe, os…).
Les acides aminés et amines biogènes sont très abondants dans ces échantillons. Cependant ces molécules ne proviennent pas toutes de la neurotransmission entre deux cellules nerveuses(Shah A.J. et al., 1999), elles peuvent être issues des voies de synthèse ou des métabolismes intracellulaires.
D’autres méthodes ont été développées pour collecter les neurotransmetteurs dans les liquides extracellulaires afin d’étudier la transmission chimique seule et en minimisant les pertes d’échantillons.
30
II.
La perfusion de type push-pull
1) La perfusion classique
Cette technique, introduite par Gaddum en 1961 et développée par Myers en 1986 (Myers R.D., 1986), est la première utilisée pour collecter le liquide extracellulaire du système nerveux central. Cette méthode repose sur l’écoulement d’un fluide physiologique (liquide de Ringer) et le prélèvement du liquide extracellulaire à travers un système de double canule dans le tissu cérébral. C’est un système ouvert où le liquide est directement en contact avec les tissus cérébraux. Les composés présents dans le liquide extracellulaire sont ainsi collectés par l’intermédiaire d’une canule coaxiale.
Cette technique a longtemps été utilisée comme méthode de prélèvement de molécules extracellulaires dans différentes régions du cerveau(Myers R.D. et al., 1998).
Cependant, elle a été abandonnée au profit de la microdialyse à cause des lésions qu’elle entraînait près des régions perfusées. Les dégâts provenaient principalement de la taille des sondes et de leurs débits de perfusion.
Cette méthode, longtemps délaissée, connaît une profonde renaissance grâce à la miniaturisation des procédés(Zhang X. et al., 1992).
2) Le système push-pull à faible débit
La perfusion push-pull à faible débit (nanodébit) est réintroduite en 2002 par Shippy et ses collaborateurs(Shippy A. et al., 2002). Le principe de cette technique est identique à celui décrit dans le paragraphe précédent. La seule différence vient de la miniaturisation des matériaux utilisés favorisant l’infusion de débits de l’ordre du nanolitre. Le schéma de la Figure 7 représente le montage de ce système. Une sonde push-pull de 3 cm de long est fabriquée à partir d’une canule en acier inoxydable de dimension 50/150 µm de diamètre interne et externe et d’un capillaire en silice fondue. Ce capillaire est relié à une pompe à vide réglée pour créer un débit de 10-50 nl/min. A l’autre extrémité, une solution de liquide physiologique est infusée à travers un capillaire de silice fondue via un pousse seringue.
31 Figure 7 : Montage d'un système de perfusion de type push-pull à nanodébit(Shippy A. et al., 2002).
Cette nouvelle méthode réduit la détérioration des cellules analysées, principal inconvénient de la méthode de perfusion tout en optimisant la diffusion des molécules. En effet des études comparatives entre la microdialyse et la perfusion push-pull ont été réalisées sur la noradrénaline dans les tissus cérébraux. Ces études démontrent que le taux d’extraction est identique pour les deux méthodes (Lisi T.L. et al., 2003) ainsi que les lésions engendrées sur les échantillons lors des analyses(Myers R.D. et al., 1998). En 2005, Kennedy et ses collaborateurs développent une puce microfluidique avec ce système de perfusion pour collecter et analyser in vivo et en temps réel les neurotransmetteurs d’un cerveau de rat(Cellar N.A. et al., 2005).
III.
La microdialyse
1) Principe
La microdialyse, introduite par Delgado et Ungersted au début des années 70 (Delgado J.M. et al., 1972; Ungerstedt U. and Pycock C., 1974), est de loin la technique la plus répandue pour la collecte de fluide extracellulaire. Cette méthode, à l’inverse de la technique de perfusion push-pull est un système fermé sans contact direct avec les tissus cérébraux. La microdialyse est constituée d’une sonde avec, à son extrémité, une membrane de dialyse semiperméable. A l’intérieur de la sonde, s’écoule du liquide physiologique par le biais d’une pompe, un équilibre est alors créé avec les tissus interstitiels autour de la sonde. Les molécules présentes dans le fluide extracellulaire
27 gage SS tube Tygon
epoxy
75/360 capillary Syringe pump
50/150 capillary 28 gage SS tube
Collection tygon tube Regulator and vacuum pump
32
diffusent à travers la membrane de dialyse suivant un gradient de concentration et sont collectées à la sortie de la sonde (Figure 8) (Bellander B.M. et al., 2004).
Figure 8 : Principe de la microdialyse. Les flèches noires représentent l’écoulement du liquide artificiel et les flèches rouges la diffusion des molécules du liquide extracellulaire.
Des agents pharmacologiques peuvent être introduits dans le liquide de Ringer et diffuser vers les cellules cérébrales à travers la membrane de dialyse : c’est la technique de rétrodialyse (Elmquist W.F. and Sawchuk R.J., 1997).
2) Applications
La microdialyse a largement été utilisée dans la recherche mais aussi en clinique dans différentes applications (Hutchinson P.J. et al., 2000; Shuaib A. and Siddiqui M.M., 2001). Des études pharmacodynamiques et pharmacocinétiques ont pu être menées grâce à la technique de rétrodialyse (Elmquist W.F. and Sawchuk R.J., 1997; Zhou Q. and Gallo J.M., 2005).
Cette méthode peut s’appliquer sur de nombreux tissus humains ou animaux. Chez l’animal (principalement des rats), en plus des tissus cérébraux, les organes tels que les reins, le foie et le cœur ont été perfusés pour comprendre le comportement de certaines molécules ou observer les effets d’un agent pharmacologique (De la Pena A. et al., 2000; Richards D.A. et al., 2007). Chez l’Homme, la microdialyse a été utilisée cliniquement au niveau sanguin (Hernandez L. and Paez X., 1997), musculaire (Arner P., 1999) et aussi au niveau cérébral pour des soins intensifs par exemple (Bellander B.M. et al., 2004).
Infusion de liquide cérébral artificiel
Collecte de l’échantillon
Diffusion des molécules Diffusion des molécules
Peau
33 3) Avantages et limites de la microdialyse
De nombreuses applications autour de la microdialyse se sont développées ces dernières années, de part les avantages que présente cette technique par rapport aux méthodes de perfusions push-pull classiques décrites auparavant. En effet, la membrane de dialyse ne permet de diffuser que des molécules de bas poids moléculaires. Cette sélectivité empêchant la diffusion des enzymes, les substances récoltées dans le microdialysat sont moins sujettes aux possibles dégradations enzymatiques et sont donc plus stables pour l’analyse(Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995). Les neurotransmetteurs présents dans l’échantillon peuvent être identifiés et dosés avec des techniques séparatives telle que la chromatographie liquide. La microdialyse présente l’avantage d’éviter le prélèvement de liquide cérébral et le contact direct du liquide avec les tissus, ce qui diminue les risques de contamination des échantillons. De plus, les dégâts au niveau des cellules, causés par l’implantation de la sonde et par le débit de perfusion sont réduits par rapport à la perfusion push-pull classique mais similaires avec la perfusion push-pull miniaturisée. Enfin, des agents pharmacologiques peuvent être administrés de manière constante vers les cellules et cette technique couplée à des appareils d’analyse permet d’étudier on-line le comportement des neurotransmetteurs vis-à-vis de ces molécules exogènes.
La microdialyse présente toutefois quelques limitations dans certaines applications. L’avantage de la sélectivité de la membrane peut effectivement devenir un inconvénient lors de l’analyse de peptides. Ces composés de masse moléculaire supérieure à celle des neurotransmetteurs classiques diffusent plus lentement à travers la membrane de dialyse (Clough G.F., 2005). L’ordre de grandeur des sondes d’analyses (1-4mm) peut limiter les régions implantables et notamment chez les petits animaux comme les rats. Enfin, cette méthode a l’inconvénient d’influencer le métabolisme et de légèrement modifier les concentrations des molécules (Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995).
IV.
Conclusions
L’utilité de ces techniques dans l’étude des neurotransmetteurs a largement été décrite dans la littérature au cours de ces quarante dernières années. Le prélèvement d’échantillons permet de localiser les molécules dans toutes les régions du cerveau. Cependant les protocoles d’extraction peuvent être longs et les pertes de volumes assez conséquentes. De plus il est difficile de déterminer la fonction de l’analyte, c’est-à-dire s’il est extrait de la transmission chimique, de sa voie de synthèse ou de sa dégradation…
34
Les techniques de perfusion (push-pull ou microdialyse) ont été développées afin de limiter ces problèmes d’extraction et pour analyser les molécules issues de la fente synaptique lors de la neurotransmission. Elles ont permis d’élargir les domaines d’application avec notamment la possibilité d’administrer des agents pharmacologiques pour étudier les effets dynamiques ou cinétiques de ces agents sur la concentration en neurotransmetteurs. Ces deux méthodes, par leurs avantages et leurs limitations, sont complémentaires. La seule différence entre ces deux techniques ne repose que sur le système d’écoulement, ouvert pour la perfusion push-pull ou fermé pour la microdialyse. Le choix de la méthode réside donc dans le type de molécule et dans son site d’analyse. La technique push-pull sera favorisée pour analyser des molécules à plus fort poids moléculaire (polypeptides) et dans des petites régions du cerveau par exemple. A l’opposé, la microdialyse, de part sa sélectivité membranaire sera préférée pour l’analyse de neurotransmetteurs dans des tissus cérébraux riches en molécules.
35
C.
Méthodes d’analyse et de quantification
Différents systèmes analytiques ont été développés afin de répondre aux exigences des méthodes d’échantillonnage décrites antérieurement :
- Des systèmes dits « immunochimiques » fondés sur la reconnaissance spécifique ligand - récepteur.
- Des systèmes électrochimiques utilisant le potentiel rédox spécifique des molécules analysées.
- Des techniques séparatives basées sur les propriétés physicochimiques des molécules (polarité, charge, masse…).
I.
Les méthodes immunochimiques
Le principe de ces méthodes, introduites par Yalow et Berson en 1960, repose sur la reconnaissance spécifique antigène-anticorps. Deux types d’approche ont été développés : la première est fondée sur la compétition entre un antigène marqué de concentration connue et l’antigène à doser, pour se fixer avec l’anticorps de quantité déterminée (Figure 9). La seconde, non compétitive, est constituée d’anticorps marqués en excès sur lesquels se fixent les antigènes à doser (Zonszain F. et al., 1992).
Figure 9 : Principe du dosage immunochimique : dosage compétitif (en haut) et dosage non compétitif (en bas).
Ag à doser Ag marqués Ac fixés limitant Marqueurs liés Marqueurs libres Ac : Anticorps Ag : Antigènes Ac fixés en excès Ac marqués Ag à doser Marqueurs liés Marqueurs libres
36
Les marqueurs d’antigènes (ou d’anticorps) peuvent être d’origine radioactive : c’est la technique de radio-immunologie (RIA), enzymatique (méthode ELISA) ou luminescente(Holme D.J. and Peck H., 1998).
Ces méthodes sont appliquées à l’analyse de neurotransmetteurs dans les fluides biologiques avec de bonnes sensibilités due à sa spécificité. Cependant, la mise en œuvre de telles méthodes est longue et l’analyse quantitative peut être délicate.
Les systèmes immunochimiques peuvent être couplés à la microdialyse pour doser in vivo des neurotransmetteurs tels que les enképhalines (Marinelli P.W. et al., 2005), le glutamate (Zilkha E. et al., 1995) ou l’acide gamma-aminobutyrique (Cook C.J., 1998).
II.
Les techniques électrochimiques
La technique la plus couramment utilisée est la voltamétrie. C’est une méthode polarographique basée sur la mesure du flux de courant résultant de la réduction ou de l’oxydation des composés sous l’effet d’une différence de potentiel. Ce système est constitué de trois électrodes :
Une électrode de travail où a lieu la réaction d’oxydation (ou de réduction) de l’analyte.
Une électrode de référence qui impose un potentiel spécifique et constant à l’électrode de travail.
Une électrode auxiliaire (ou contre-électrode) qui assure le passage du courant entre la mesure et la pile.
Ce système ne peut donc s’étendre qu’aux molécules oxydables. Un potentiel électrique est appliqué à l’électrode de travail qui recueille les électrons arrachés aux molécules. Le courant d’électrons engendré, appelé courant d’oxydation, est proportionnel à la concentration de molécules oxydées. De plus, le potentiel appliqué à cette oxydation est spécifique des substances analysées. C’est donc à la fois une méthode de mesure qualitative et quantitative de composés électroactifs (Holme D.J. and Peck H., 1998; Michael D.J. and Wightman R.M., 1999).
Le développement des électrodes à fibres de carbone et leurs miniaturisations (≈100µm de diamètre interne) ont permis de mesurer les variations de concentration de certains neurotransmetteurs in vivo et en temps réel, en implantant directement ces microélectrodes dans les tissus cérébraux avec une détérioration limitée (Michael D.J. and Wightman R.M., 1999; Robinson D.L. et al., 2003).
Malgré ces nombreux avantages, les techniques électrochimiques ont toutefois une application restreinte car elles ne s’appliquent qu’aux molécules oxydables et à une substance à la fois.
37
III.
Les techniques séparatives
Ces techniques permettent de séparer et de doser plusieurs molécules dans un même échantillon. Deux types d’appareillage ont principalement été développés pour l’analyse de neurotransmetteurs : l’électrophorèse capillaire (CE) et la chromatographie liquide haute performance (HPLC).
1) Electrophorèse capillaire
L’électrophorèse capillaire (CE) en tant que technique analytique a été introduite par Mikkers et ses collaborateurs en 1979 (Mikkers F. et al., 1979) sur des tubes de diamètres élevés puis par Jongerson en 1981 sur des capillaires micrométriques (Jorgenson J.W. and Lukacs K.D., 1981). C’est un appareil constitué d'un capillaire ouvert dont les extrémités plongent dans deux réservoirs d'électrolyte. Une différence de potentiel est appliquée à chaque extrémité du capillaire et un détecteur est branché avant la sortie du tube.
La séparation des composés résulte de deux mécanismes de transport, l’électromigration et l’électro-osmose.
L’électromigration est le déplacement d’une espèce chargée lorsqu’elle est soumise à un champ électrique. La mobilité électrophorétique de l’espèce chargée est fonction de sa charge électrique et de sa masse. Le transport des cations s'effectue dans le sens du champ électrique et le transport des anions dans le sens opposé (Figure 10).
Figure 10 : Représentation de la mobilité électrophorétique
L’électro-osmose résulte de l’interaction de l’écoulement de la solution avec la silice du capillaire. Cette silice est constituée de fonction silanols qui se déprotonnent dès pH > 2. Les cations présents dans l’électrolyte forment une double-couche avec les anions de la paroi de la silice. Cette double couche chargée positivement et négativement présente une différence de potentiel appelée potentiel zêta. Dès l’application du champ électrique, les cations de la double couche se déplacent vers la cathode et entraînent les molécules électrolytiques de l'échantillon : c'est le flux électroosmotique (Figure 11).
38
Figure 11 : Représentation du flux électro-osmotique
La migration des molécules provient de la somme des vitesses de ces deux phénomènes. Ainsi, lorsqu’un champ électrique est appliqué, les cations se déplacent à une vitesse correspondant à la somme des flux électrophorétiques et electro-osmotiques. Les molécules neutres ne dépendent que du flux electro-osmotique et les anions sont plus retenus car leur vitesse correspond à la somme des flux électro-osmotiques et des migrations electrophorétiques opposées au champ électrique (Figure 12).
Figure 12 : Principe de la séparation en électrophorèse capillaire
Les solutés sont donc séparés en fonction de leur mobilité electrophorétique, c’est-à-dire leur rapport charge/diamètre d’ion solvaté (Z/R). Ce principe est utilisé en électrophorèse capillaire de zone (capillary zone electrophoresis CZE) (Taverna M. et al., 2003). Trois autres méthodes basées sur ce principe sont principalement utilisées pour l’analyse des neurotransmetteurs.
L’électrophorèse capillaire électrocinétique micellaire (micellar electrokinetic capillary chromatography MEKC) qui permet de séparer les composés selon le rapport Z/R et leur hydrophobie. Un tensio-actif, le plus couramment du dodécyle sulfate de sodium (SDS), est ajouté à l’électrolyte pour former des micelles de mobilité électrophorétique négative. Les molécules neutres encapsulées migrent alors avec la micelle (Terabe S. et al., 1985).
L’électrophorèse capillaire sur gel (capillary gel electrophoresis CGE) sépare les molécules en fonction de leur taille dans un gel constitué de polymères (Miksik I. et al., 2006).
39 L’électrochromatographie capillaire (capillary electrochromatography CEC) combine le principe de la chromatographie liquide (phase stationnaire) et celui de l’électrophorèse capillaire (flux électro-osmotique). Les composés sont séparés suivant leur coefficient de partage dans la phase stationnaire et l’électrolyte, et en fonction de leur rapport Z/R (Eeltink S. and Kok W.T., 2006).
De part sa faible quantité de volume nécessaire à l’injection, l’électrophorèse capillaire peut directement être couplée à la technique de microdialyse. Cette méthode permet ainsi de suivre in vivo l’évolution d’un ou de plusieurs neurotransmetteurs. Il est cependant nécessaire d’obtenir des électrophorégrammes avec des temps d’analyses relativement courts (Powell P.R. and Ewing A.G., 2005).
2) Chromatographie liquide à haute performance
La chromatographie liquide à haute performance (high performance liquid chromatography, HPLC) a été développée en 1968 par Giddings (McLaren L. et al., 1968). Le principe de séparation repose sur l’interaction des solutés entre deux phases non miscibles : la phase stationnaire qui est fixe et la phase mobile (Figure 13) (Caude M. and Jardy A., 1996).
Figure 13 : Principe de la chromatographie liquide haute performance
Afin de couvrir un large domaine d’application, plusieurs modes de HPLC ont été développés suivant le type de molécules à analyser. Les composés de masse molaire supérieure à 10000 g/mol sont généralement séparés selon leurs tailles par la chromatographie d’exclusion : à perméation de gel pour les molécules non polaires ou à filtration de gel pour les espèces polaires ou ioniques. Dans le cas de petites molécules, la chromatographie d’adsorption est principalement utilisée pour les espèces non polaires ; les analytes, en compétition avec la phase mobile, sont adsorbés sur la surface d’un solide (phase stationnaire). La chromatographie par échange d’ions permet de séparer des composés ioniques ; la phase stationnaire est dans ce cas, une résine échangeuse d’ions. Pour les espèces non ioniques et polaires telles que les neurotransmetteurs de types acides
40
aminés, la chromatographie de partage sera privilégiée (Skoog D.A. et al., 1997). C’est le type de chromatographie liquide le plus utilisé, notamment dans les domaines d’application en chimie pour l’industrie pharmaceutique, en biochimie, en agrochimie…
a) Principe de la chromatographie de partage
La chromatographie de partage peut être divisée en deux catégories : la chromatographie liquide-liquide et liquide–phase greffée. Dans le premier cas, la phase stationnaire est un solvant immobilisé par adsorption physique sur la surface du support. Dans le cas de la chromatographie de partage liquide-phase greffée, la phase stationnaire est généralement sous forme de billes de silices greffées (Figure 14). De part la stabilité de cette phase, la chromatographie de partage liquide-phase greffée est la plus utilisée de nos jours (Skoog D.A. et al., 1997).
Figure 14 : Photographie de billes de silice
La séparation des composés dépend de deux paramètres principaux : la nature de la phase stationnaire et de la phase mobile. Les molécules peuvent, selon leurs affinités, migrer avec la phase mobile ou être retenues par la phase stationnaire. La phase mobile, dite éluant, est constituée d’un solvant ou d’un mélange de solvants de grandes puretés.
Selon les fonctions chimiques greffées sur la silice et la polarité de la phase mobile, deux types de chromatographie de partage peuvent alors être distingués. Si la silice est greffée de groupements fonctionnels polaires (CN, NH2 …), la phase mobile sera
relativement apolaire. Dans ce cas les molécules les plus polaires auront une grande affinité avec la phase stationnaire et une faible interaction avec l’éluant : c’est la HPLC en phase directe ou classique. Si la silice est constituée de longues chaînes alkyles de type C8 ou C18 : les composés les moins polaires seront plus retenus, de part leurs interactions avec la phase de la colonne, que les composés plus polaires. C’est la HPLC en phase inverse (reverse phase high performance liquid chromatography RP-HPLC).
41 b) les phases stationnaires en phase inverse
La phase stationnaire sous forme de colonne est l’élément clé d’une bonne séparation chromatographique. Les billes de silice qui la constituent, sont synthétisées à partir de silanes polymérisés. Sur les fonctions silanols sont greffés des groupements chimiques alkylés de types C18 par exemple (Figure 15).
Figure 15 : Représentation d'une bille de silice greffée
Les fonctions silanols (Si-OH) de surface ne sont toutefois pas toutes greffées, la phase stationnaire contient plus ou moins des groupements silanols libres. Les Si-OH résultants engendrent des interactions hydrophiles parasites, les résultats ne sont plus dans ce cas reproductibles. Pour pallier ce problème, les Si-OH de surface sont remplacés par des Si-O-CH3 : c’est le « capping ». Le taux de greffage et le processus de «
end-capping » sont donc des paramètres importants pour la résolutivité des phases stationnaires.
A l’achat, trois grandeurs caractérisent les colonnes en plus du type de phase greffée : la longueur, le diamètre et la granulométrie (diamètre des particules).
La longueur et le diamètre joue principalement sur la durée de la séparation, plus la colonne est courte, plus vite les molécules sont éluées.
La taille des particules influence deux paramètres : la pression dans la colonne et l’efficacité de la séparation. En effet, pour des longueurs de colonnes égales, les molécules diffusent plus rapidement lorsque les particules sont plus fines. De plus la pression dans le système augmente avec la dimunition du diamètre (Caude M. and Jardy A., 1996).
42
c) Appareillage
Un appareil de chromatographie liquide est constitué d’un système de pompage, d’un système d’injection et d’un détecteur (Figure 16). Le système de pompage assure l’élution des solvants soit en mode isocratique, c’est-à-dire dans des proportions constantes, soit sous forme de gradient (compositions variables au cours du temps). Ce système doit répondre à un certain nombre de contraintes :
- son rendement (ratio du débit délivré par la pompe sur le débit demandé) doit être indépendant de la nature du solvant
- le débit doit être constant et reproductible
- le mélange des différentes compositions du solvant lors de gradients doit être reproductible et efficace
- les pompes doivent supporter des hautes pressions (400 bars environ).
Pour répondre à ces requêtes des pompes à piston permettant l’aspiration et le refoulement des éluants ont été développées. Ces pompes présentent l’avantage de posséder de petits volumes morts, d’atteindre des pressions élevées (jusqu’à 700 bars), d’être adaptable à la technique du gradient et d’avoir des débits constants et indépendants de la nature du solvant et de la pression à l’entrée de colonne (Caude M. and Jardy A., 1995).
Figure 16 : Schéma d'un appareil basse pression de chromatographie liquide à haute performance
Les composés sont généralement introduits via des injecteurs capables de supporter les pressions élevées en tête de colonne. Pour se faire, des vannes à boucle d’échantillonnage manuelle ou automatique avec un système de passeur, ont été mises au point. Son fonctionnement est le suivant : l’échantillon injecté dans la boucle est entraîné
Vanne de mélange Solvant A Solvant B Pompe Echantillon Colonne HPLC Détecteur Poubelle Injecteur Système d’aquisition
43 par la phase mobile en tête de colonne par rotation de la vanne. Une autre rotation permet ensuite le rinçage de la boucle. L’injection automatique assure une meilleure reproductibilité du volume d’injection, nécessaire à l’étalonnage externe des composés (Caude M. and Jardy A., 1995).
d) Evolutions récentes
Au cours de ces trente dernières années, les phases stationnaires ont évolué vers une granulométrie plus fine afin de gagner en temps d’analyse et en résolution. Les débits d’élution ont été optimisés pour compenser les fortes pressions dues aux fines granulométries des colonnes. Les pompes permettent alors d’éluer des solvants à des débits de l’ordre du microlitre et du nanolitre ; les termes de microHPLC (µHPLC) et de nanoLC sont alors utilisés.
En 2004, des pompes capables de générer de très hautes pressions ont été développées afin d’être appliquées à des colonnes de granolumétrie de 1,7 µm. C’est la chromatographie liquide ultra haute performance (UPLC). Cette technique permet d’analyser des échantillons très complexes en quelques minutes avec d’excellentes résolutions chromatographiques (Swartz M.E., 2005).
3) Modes de détections
Les détecteurs permettent de visualiser la séparation chromatographique via un système d’acquisition informatique (Figure 16). Ils sont caractérisés par leur sélectivité, c’est-à-dire le type de molécules qu’ils peuvent détecter, et leur sensibilité : la quantité minimale détectable. Un détecteur à la fois sensible et universel n’existant pas, de nombreux détecteurs basés sur différents principes ont été développés avec l’essor de ces techniques séparatives (HPLC et CE). Ces appareils peuvent toutefois être caractérisés selon les propriétés chimiques des analytes mis en jeu.
a) Le réfractomètre différentiel
La réfractométrie différentielle permet de mesurer en continu la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’analyte séparé dans la colonne. La détection dépend de la nature de l’éluant et celle du soluté, la réponse est donnée par la relation :
R1 = Z(n-n0) Avec Z : constante caractéristique de l’appareil
n : indice de réfraction en sortie de colonne n0 : indice de réfraction de la phase mobile
44
De part cette relation, il est nécessaire d’avoir un bruit de fond constant. Il est donc impossible d’utiliser une élution sous forme de gradient avec ce type d’appareil. Le réfractomètre peut détecter toutes les molécules qui ont un indice de réfraction différent de celui de l’éluant. Cependant, il est très sensible aux variations de températures, de débits et de pression. Les limites de détection sont donc élevées par rapport aux détections spectroscopiques ou aux détecteurs à diffusion de la lumière (Ivanov A.R. et al., 2000).
b) Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL)
Le principe de ce détecteur est fondé sur l’évaporation partielle des solutions en sortie de colonne, le brouillard de particules formé avec un nébuliseur traverse un faisceau lumineux. La lumière diffusée sous un angle déterminé est détectée par un photomultiplicateur. Ce type de détection est donc limité à l’emploi de phases mobiles volatiles et d’analytes moins volatils. La détection dépend de la taille des particules diffusant la lumières. La réponse n’est pas directement proportionnelle à la quantité de molécules injectées mais peut cependant être linéarisée sous forme logarithmique. Dans le cas de l’analyse de neurotransmetteurs les limites de détection varient de 20mg/L à 56 mg/L selon l’acide aminé analysé (Yan D. et al., 2007).
c) Détection UV-visible
La spectrophotométrie UV-visible permet de détecter des molécules qui absorbent dans l’UV et le visible. La réponse de ce type de détecteur est fondée sur la loi de Beer-Lambert :
A = IT/I0= ε(λ).l.C
Avec I0 intensité optique transmise
IT intensité optique de référence
ε(λ) absorptivité molaire du soluté à la longueur d’onde λ
l longueur du trajet optique
C concentration du soluté dans l’éluant
Il existe plusieurs types de spectrophotomètres classifiables selon leur degré d’information :
- Les spectrophotomètres où la longueur d’onde est fixée pas l’opérateur. - Les détecteurs dont la longueur d’onde est programmable en sensibilité au
45 - Les spectrophotomètres à barrette de diodes qui permettent une acquisition
en trois dimensions : absorbance-longueur d’onde-temps.
Quelques neurotransmetteurs de type acides aminés absorbent dans l’UV à de faibles longueurs d’onde (190-300 nm) grâce à leur fonction aromatique. Les limites de détections sont de l’ordre de du mg/L avec ce mode de détection (Petritis K. et al., 2002).
d) Détection de fluorescence
Ce type de détection possède une grande sélectivité et une sensibilité élevée. Le principe de la fluorescence est décrit en trois étapes par le diagramme de Jablonski (Lakowicz J.R., 1999):
- La molécule fluorescente (ou fluorochrome) absorbe des photons dans l’UV et passe d’un état électronique fondamental (S0) à un état singulet excité (Sn).
- L’énergie absorbée (Sn) peut être dissipée sous forme de chaleur ou par des
conversions internes. Le fluorochrome perd en énergie interne et passe à un état singulet excité plus faible (S1).
- La fluorescence est le retour de l’état excité de la molécule à son état fondamental (S0) avec la ré-émission d’un photon.
Figure 17 : Diagramme de Jablonski décrivant le principe de la fluorescence
La sensibilité de ce type de détecteur est environ pour une même molécule mille fois supérieure à celle de la spectrophotométrie UV. Les limites de détection pour des neurotransmetteurs naturellement fluorescents sont de l’ordre du nanomole/L (Lapainis T. et al., 2007).
Ces détecteurs sont équipés d’une source lumineuse, de filtres d’excitation appelés monochromateur d’excitation, d’une cellule d’analyse et de filtres d’émission. Le principe de fonctionnement est le suivant : la source lumineuse traverse le monochromateur à une longueur d’onde choisie, le faisceau lumineux émergeant excite la molécule présente dans
