Matériel et Méthodes
IV- 2 Etude de la corrélation entre le squalène et la toxicité de l’! synucléine
Chez S. cerevisiae, l’époxydation du squalène, catalysée par Erg1p, est une étape potentiellement affectée par l’absence de gouttelettes lipidiques (Sorger, et al., 2004). En effet, l’absence de gouttelettes entraine une diminution de la stabilité cellulaire de cette enzyme. L’instabilité de Erg1p engendre une diminution de la quantité cellulaire de cette protéine et par conséquent une réduction de l’époxydation du squalène et de la biosynthèse de l’ergostérol. La réduction de l’époxydation du squalène pourrait entrainer une accumulation cellulaire de ce composé. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons quantifié le squalène dans chacune des souches G175 et H1246. L’analyse des résultats obtenus, par chromatographie en phase gazeuse, montre que le quadruple mutant H1246 contient trois fois plus de squalène que la souche sauvage G175 (figure 51). Ainsi, l’absence de gouttelettes lipidiques entraine une accumulation importante du squalène. L’accumulation de squalène a été également constatée chez S. cerevisiae traité avec le pro-oxydant
H2O2 (Branco, et al., 2004; Pedroso, et al., 2009). Par conséquent, nous avons étudié
l’effet de l’accumulation du pro-oxydant !-synucléine sur la biosynthèse du squalène. Les résultats de la figure 51, montrent que l’induction de l’!-synucléine entraine une accumulation cellulaire du squalène dans les souches G175 et H1246. Cependant, la quantité de squalène dans la souche H1246 + !-syn est supérieure à celle de la souche G175 + !-syn (21,9 ± 0,1 !g contre 16,33 ± 0,9 !g). En d’autres termes, la souche mutante H1246 contient une plus grande quantité de l’antioxydant squalène que la souche sauvage G175.
Figure 51 : Effet de l’!-synucléine sur le contenu cellulaire en squalène. Les cellules ont été cultivées pendant 6 heures en milieu inductif de l’!-synucléine puis les lipides extraits et saponifiés. Le squalène a été analysés et quantifiés par CPG. Les barres d’erreur représentent la moyenne de l’erreur standard. "
*
" Indique que la différence est significative par rapport à la valeur de la souche G175 pour p < 0,05. "**
" Indique que la différence est significative par rapport à la valeur de la souche H1246 pour p < 0,05.Suite à la surexpression de l’!-synucléine, la quantité de cet antioxydant (squalène) dans la souche mutante H1246 est supérieure à celle contenue dans la souche sauvage G175. Ainsi la tolérance de la souche H1246, vis-à-vis de l’!- synucléine, pourrait être liée à sa quantité élevée de squalène. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons étudié l’effet de l’inhibition partielle de biosynthèse du squalène et des stérols sur la toxicité cellulaire induite par l’!-synucléine. Pour ce faire, les cellules ont été ensemencées sur milieu YP galactose contenant de la lovastatine à une concentration finale de 40 mM. La lovastatine est un inhibiteur de la HMG-CoA réductase, enzyme intervenant dans une étape précoce de la synthèse des stérols (figure 3). D’après la photographie de la figure 52, à la concentration de 40 mM, la lovastatine affecte la croissance des souches G175 et H1246 en empêchant la synthèse des stérols, composés essentiels des cellules eucaryotes. Toutefois, la présence de la lovastatine inhibe d’avantage la croissance des cellules exprimant l’!-synucléine. Le niveau d’inhibition est fonction de la quantité cellulaire de squalène. En effet la souche H1246 + !-syn avec une quantité relativement élevé
de squalène est moins affectée par la présence de la lovastatine que la souche G175 + !-syn. Donc la quantité cellulaire de squalène pourrait moduler la toxicité de l’!- synucléine.
Figure 52 : Effet de l’inhibition de la synthèse du squalène et des stérols sur la toxicité de l’!-synucléine. Les cellules ont été diluées en série puis cultivées sur différents milieux. (A) Culture sur milieu YP galactose où l’!-synucléine est induite. (B) Culture sur milieu YP galactose contenant la lovastatine, un inhibiteur de la voie des stérols.
Discussion
L’!-synucléine est une protéine préférentiellement exprimée au niveau des terminaisons présynaptiques des neurones. Dans ces cellules nerveuses, les
fonctions natives de l’!-synucléine ne sont pas complètement comprises. De nombreuses études suggèrent l’implication de l’!-synucléine dans la régulation de la synthèse, du recrutement, de la compartimentation, du transport et de la sécrétion de la dopamine au niveau des synapses (Drolet, et al., 2006; Jenco, et al., 1998; Lotharius and Brundin, 2002; Ostrerova, et al., 1999; Perez, et al., 2002; Sidhu, et
al., 2004; Yavich, et al., 2004). En plus d’altérations de ces fonctions présumées, la
surexpression, la mutation ou l’agrégation de l’!-synucléine sont responsables de la neurodégénérescence au cours des synucléiopathies comme la maladie de Parkinson. Cependant, comment et pourquoi cette protéine s’agrège et entraine la mort cellulaire demeurent mal connus. C’est pour cette raison que de nombreux modèles sont utilisés pour étudier la pathobiologie de l’!-synucléine. Parmi ces modèles, la levure S. cerevisiae s’avère un organisme d’intérêt car, en plus d’être aisément manipulable en laboratoire, la surproduction de l’!-synucléine dans ces cellules a des conséquences assez similaires à celles observées lors de la neurodégénéréscence dans la maladie de Parkinson. De plus, cette levure offre des possibilités pratiques facilitant la mise en place de cribles pour une première étape de recherche thérapeutique contre la toxicité liée à cette protéine (Kritzer, et al., 2009; Willingham, et al., 2003).
Dans les cellules nerveuses ainsi que chez S. cerevisiae, la surexpression de l’!-synucléine déclenche une accumulation cellulaire de ROS. Cette augmentation de la quantité de ROS a été également observée dans les cellules G175 et H1246 exprimant l’!-synucléine. Le mécanisme moléculaire qui entraine l’accumulation de ROS n’est pas encore élucidé. Cependant, au moins deux hypothèses pourraient expliquer l’accumulation de ROS en présence de l’!-synucléine. D’une part, l’!-
synucléine au moyen d’une séquence signal de son extrémité NH2 est capable de se
fixer à la membrane interne mitochondriale (Devi, et al., 2008). Cette accumulation membranaire pourrait inhiber l’activité du complexe I mitochondrial et par conséquent entrainer une accumulation intracellulaire de ROS (Devi, et al., 2008).
D’autre part l’accumulation de l’!-synucléine entraine une inhibition du trafic vésiculaire (Cooper, et al., 2006; Thayanidhi, et al., 2010) avec pour conséquence possible le stress du réticulum endoplasmique (Smith, et al., 2005) et la libération du calcium dans le cytosol. Le calcium ainsi libéré du réticulum endoplasmique est susceptible de dépolariser la membrane interne mitochondriale conduisant à une production de ROS (Malhotra and Kaufman, 2007). L’inhibition du trafic vésiculaire serait une cause directe de la mort cellulaire en présence de l’!-synucléine. Ainsi
chez S. cerevisiae, la restauration pharmacologique ou génétique (surexpression du gène YPT1, codant une protéine essentielle du trafic vésiculaire entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi) du trafic vésiculaire, empêche la mort cellulaire induite par l’!-synucléine (Cooper, et al., 2006; Su, et al., 2010).
En présence de l’!-synucléine, il y a accumulation cellulaire de lipides neutres (figure 27 et 28). Des études antérieures confirment également l’accumulation de lipides neutres sous forme de gouttelettes lipidiques suite à la surexpression de l’!- synucléine chez S. cerevisiae (Outeiro and Lindquist, 2003a). Cette accumulation pourrait être une stratégie cellulaire permettant de limiter les effets délétères de l’inhibition du trafic vésiculaire. En effet le blocage du trafic entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi inhibe la biosynthèse des phospholipides au profit de l’accumulation des lipides neutres (Gaspar, et al., 2008). L’accumulation cellulaire de lipides neutres serait alors un moyen de canaliser l’excédent d’acides gras néosynthétisés vers les gouttelettes lipidiques. Le stockage de ces acides gras dans les gouttelettes lipidiques protège les cellules de la lipotoxicité qu’auraient engendré ces acides gras excédentaires. En accord avec cette hypothèse, l’altération fonctionnelle de sec13p, sous-unité essentielle des vésicules de transport COPII, inhibe le trafic vésiculaire entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi avec pour conséquence l’accumulation cellulaire de TAG (Gaspar, et al., 2008). Par ailleurs, une étude in vitro a montré que l’accumulation de TAG protège les cellules de mammifères de la lipotoxicité induite par les acides gras (Listenberger, et al., 2003a). Donc l’accumulation de TAG pourrait protéger de la lipotoxicité suite à l’inhibition du trafic vésiculaire.
En plus de l’accumulation de lipides neutres, nous avons montré que la surexpression de l’!-synucléine chez S. cerevisiae entraine une augmentation de l’activité acides gras synthase (figure 30) et du contenu cellulaire d’acides gras (figure 29). De plus, nos résultats montrent que l’acide gras synthase pourrait intervenir dans la détoxification de l’!-synucléine chez S. cerevisiae. En effet la surexpression de l’acide gras synthase restaure la croissance cellulaire en présence de l’!-synucléine (figure 31), tandis que l’inhibition partielle de cette enzyme exacerbe la toxicité de l’!-synucléine (figure 34B).
L’activité acide gras synthase ainsi que la lipogenèse catalysée par cette enzyme sont associées à la pathogénèse de maladies humaines telles que le diabète de type 2 et le cancer (Menendez, et al., 2009). Il a ainsi été observé que l’inhibition de l’activité FAS dans des cellules cancéreuses réduit considérablement
leur pouvoir métastatique, et induit l’apoptose de ces cellules. Ainsi des perspectives thérapeutiques nouvelles ont été proposées en se basant sur la modulant de l’activité acide gras synthase à travers sa consommation de NADPH (Menendez and Lupu, 2007). D’après Menendez et Lupu, l’inhibition de la FAS entrainerait l’accumulation cellulaire de NADPH et par conséquent la stimulation de l’activité NADPH oxydase (NOX) (Menendez and Lupu, 2007). Les NOX étant des enzymes génératrices de ROS (radical superoxyde), la stimulation de l’activité NADPH oxydase entrainerait une accumulation cellulaire de ROS (Menendez and Lupu, 2007). Dans cette optique, l’augmentation de l’activité acide gras synthase, consommatrice de NADPH, pourrait réduire la quantité de NADPH disponible pour les NOX et par conséquent réduire la production de ROS provenant de l’activité des ces NOX. De façon similaire, la consommation de NADPH suite à l’augmentation de l’activité FAS pourrait réduire la production de ROS et protéger ainsi S. cerevisiae de la toxicité de l’!-synucléine. Toutefois, même si S. cerevisiae ne possède pas de NOX, d’autre(s) enzyme(s) pourrai(en)t avoir une fonction similaire à celle des NOX. Il faut noter que l’augmentation de la synthèse lipidique peut aussi être une source de ROS via un dysfonctionnement des mitochondries (Chen et al., 2008 ; Li, et al., 2010).
Le NADPH sert de substrat à la glutathion réductase pendant le recyclage du glutathion (GSH) à partir du glutathion disulfure (GSSG). L’augmentation de l’activité FAS entraine une plus forte mobilisation du pool de NADPH pour la synthèse d’acides gras d’où une réduction de la quantité de NADPH disponible pour la réduction du GSSG en GSH. En réponse à la diminution du recyclage du GSH, il y aura accumulation de GSSG, diminution du rapport GSH/ GGSG et par conséquent stress oxydant cellulaire. Cependant, le niveau de ce stress serait en dessous du seuil requis pour affecter la croissance cellulaire. Suite à la diminution du rapport GSH/GSSG, les cellules synthétisent du glutathion. Cette synthèse augmenterait le potentiel antioxydant cellulaire et préparerait les cellules à des stress oxydants plus sévères. Ceci pourrait expliquer pourquoi les cellules G175 surexprimant FAS (G175 + pCF8) sont plus tolérantes au pro-oxydant !-synucléine que les cellules G175. En accord avec cette hypothèse, des études ont montré que suite à l’exposition de S. cerevisiae à une concentration sub-létale de peroxyde d’hydrogène, les cellules deviennent tolérantes à des concentrations plus élevées (initialement létales) de cet oxydant (Branco, et al., 2004; Ng, et al., 2008). Des données expérimentales, démontrant le lien entre l’activité acides gras synthase et la modulation redox cellulaire, ne sont pas disponibles dans la littérature. Toutefois, notre étude montre
que la surexpression de FAS entraine une accumulation cellulaire de ROS. Ce qui étaye alors l’hypothèse selon laquelle l’augmentation de l’activité FAS induit un stress oxydant.
La surexpression de l’!-synucléine entraine le blocage du trafic vésiculaire (Cooper, et al., 2006; Thayanidhi, et al., 2010) et stimule la synthèse d’acides gras (figure 29). Afin d’éviter les effets délétères (stress du réticulum endoplasmique et ses conséquences) de l’accumulation des acides gras dans le réticulum endoplasmique, ces acides gras sont stockés sous forme de lipides neutres dans les gouttelettes lipidiques. Dans l’optique de vérifier cette hypothèse, nous avons surexprimé l’!-synucléine dans la souche de levure H1246 mutée sur les quatre gènes (ARE1 ARE2 LRO1 DGA1) responsables de l’estérification des acides gras. Cette souche mutante présente une croissance normale mais est dépourvue de lipides neutres et de gouttelettes lipidiques. Toutefois, des études montrent que du fait de l’incapacité de synthétiser les lipides neutres, le mutant H1246 est extrêmement sensible à la lipotoxicité induite par les acides gras insaturés exogènes (Garbarino, et al., 2009; Petschnigg, et al., 2009). En considérant le fait que l’!- synucléine entraine une augmentation de la quantité cellulaire d’acides gras, nous nous attendions à ce que la croissance du mutant H1246 soit sévèrement affectée suite à l’accumulation de l’!-synucléine. De manière surprenante, le mutant H1246 s’est avéré plus tolérant à l’accumulation de l’!-synucléine que la souche sauvage G175. Pour comprendre ce constat, nous avons examiné le statut redox des cellules. Ainsi le mutant H1246 possède un niveau basal de ROS largement supérieur (3,9 fois) à celui de la souche sauvage G175. De plus, le rapport GSH/GSSG dans la souche H1246 est significativement supérieur (2,2 fois) à celui dans la souche G175. Quant au potentiel redox, sa valeur chez le mutant H1246 est inférieure à celle de la souche G175. Ces résultats suggèrent que le mutant H1246 subit un stress oxydant chronique qui lui permet d’acquérir un potentiel antioxydant élevé susceptible de lui conférer un certain niveau de tolérance au pro-oxydant !-synucléine. De plus, en considérant que l’augmentation de l’activité FAS réduit la toxicité de l’!-synucléine (figure 31), nous avons également trouvé que l’activité FAS du mutant H1246 est supérieure à celle de la souche G175 (tableau 9). Ce résultat permet d’expliquer et d’étayer la tolérance relative de la souche mutante H1246 vis-à-vis de l’!-synucléine.
Une étude a montré que l’incapacité de synthétiser les TAG entraine une lipotoxicité aboutissant à la mort de S. pombe juste après l’entrée en phase stationnaire (Zhang, et al., 2003). Ces auteurs suggèrent que l’accumulation de ROS
et de DAG serait responsable de cette lipotoxicité. Ainsi l’incapacité de synthétiser les lipides neutres pourrait entrainer une accumulation du DAG dans le réticulum endoplasmique avec pour conséquence le stress du réticulum endoplasmique et la production de ROS. La souche H1246 de S. cerevisiae semble accumuler plus de MAG et de DAG que la souche sauvage G175 (figure 37). Comme chez S. pombe, les DAG et MAG accumulés pourraient être à l’origine de l’accumulation de ROS chez la souche H1246 de S. cerevisiae. Par rapport à S. pombe, l’absence de lipides neutres engendre un phénotype moins sévère chez S. cerevisiae. Toutefois, le mutant H1246 demeure très susceptible à la présence d’acides gras insaturés exogènes (Garbarino, et al., 2009; Petschnigg, et al., 2009). Cette susceptibilité se manifeste par une prolifération du réticulum endoplasmique, un stress modéré du réticulum endoplasmique, une accumulation de ROS suivi de la mort cellulaire par lipoapoptose. En addition à ces données bibliographiques, nos résultats montrent que les quatre mutations are1! are2! lro1! dga1!, entrainent une augmentation (1,5 fois) du volume cellulaire et une augmentation de l’activité acide gras synthase (tableau 9 et 11). De plus, même en absence d’acides gras exogènes, le mutant are1! are2! lro1! dga1! possède un niveau basal de ROS supérieur à celui de la souche sauvage G175 (figure 42). Donc cette souche H1246 souffrirait de façon chronique d’un stress oxydant. Ce qui expliquerait pourquoi les cellules H1246 possèdent un statut redox (GSH/GSSG) élevé leur permettant de mieux tolérer le stress oxydant induit par l’!-synucléine. Afin de confirmer nos résultats sur le statut et le potentiel redox cellulaire, nous avons étudié l’effet de la modulation du GSH cellulaire sur la toxicité de l’!-synculéine. Ainsi nous avons montré que la déplétion du GSH au moyen du CDNB exacerbe la toxicité de l’!-synucléine tandis que l’apport de GSH exogène réduit la toxicité de cette protéine (figure 49).
Nos résultats suggèrent également que le squalène pourrait contribuer à la réponse cellulaire vis-à-vis de l’!-synucléine. De nombreuses études ont montré le potentiel antioxydant du squalène. En effet, chez les cellules de mammifère, la supplémentation en squalène entraine une diminution de la quantité cellulaire de ROS (Das, et al., 2008; Warleta, et al., 2010), une augmentation de la quantité cellulaire de GSH de superoxyde dismutase et de glutathion peroxydase (Das, et al., 2008) . En accord avec ces données, nous avons observé une corrélation entre la quantité cellulaire de squalène et la toxicité du pro-oxydant !-synucléine. Ainsi la quantité cellulaire de squalène dans le mutant H1246 est significativement supérieure à celle de la souche sauvage G175. L’accumulation de squalène dans la
souche H1246 serait une conséquence de la diminution de l’activité squalène époxydase suite à la déplétion des gouttelettes lipidiques. Ce niveau basal élevé en squalène pourrait alors protéger le mutant H1246 des effets toxiques du pro-oxydant !-synucléine. De plus, en diminuant la quantité cellulaire de squalène au moyen de la lovastatine, on exacerbe la toxicité de l’!-synucléine (figure 52). Donc le squalène pourrait être un facteur clé dans la tolérance cellulaire à l’!-synucléine.