Partie III : Purification et caractérisation des PGases
Chapitre 3 : Résultats et discussions
6. Etude de la Cinétique de croissance d’Aureobasidium pullulans et de la production de
Une étude cinétique, en fermenteur de 20l, est réalisée pour mieux comprendre l'évolution de différents paramètres au cours de la fermentation et tester la capacité da la levure à s’adapter aux conditions industrielles (Résultats présentés par les figures 26 et 27).
6.1. Evolution de la biomasse au cours de la fermentation
L’évolution de la biomasse en fonction du temps sur milieu optimisé à base de déchets de tomates sous des conditions de pH contrôlées passe par trois phases majeures :
1. Une courte phase de latence est observée du temps t = 0 au temps t = 4 h. Ceci est dû probablement au fait que l’ensemencement du milieu provenant d’une préculture de 24 – 36 h. Cet inoculum a permis aux cellules levuriennes de s’adapter facilement aux conditions de culture. Pendant cette période, une consommation accrue des sucres est observée.
2. Une phase de croissance exponentielle dure une vingtaine d’heures et se poursuit jusqu’au temps 32 h, où la biomasse atteint sa valeur maximale de 7.80 g/l.
3. De 32 h à 96 h la levure entre en phase stationnaire. Par ailleurs, la phase de déclin n’est pas atteinte après 96 h de fermentation (Figure 26), résultat similaire à celui de Wang et al., (2014) pour la production de lipide par A. pullulans var. melanogenum P 10, qui rapportent qu’après 132 h de fermentation la levure est toujours en phase stationnaire.
6.2. Evolution de la production de la polygalacturonase au cours de la fermentation
La figure 26 décrit la cinétique de production de la PGase par la levure A. pullulans. L’enzyme apparaît dés le début de la fermentation et sa synthèse se poursuit jusqu’à la fin de la phase exponentielle avec une activité de la PGase maximale de 25.75 UI/ml à 32 h de fermentation. Au début de la phase stationnaire, l’activité de la PGase se poursuit jusqu’à 56 h d’incubation. Passé ce temps, la synthèse de l’enzyme diminue progressivement pour atteindre la valeur de 2.5 UI/ml en fin de culture. Cette diminution de l’activité enzymatique peut être expliquée soit par l’addition continue de l’acide phosphorique (volume de 341.7 ml) pendant la fermentation en raison de l’augmentation continue du pH, soit à l’augmentation de
112
la concentration en oxygène dissous. Ces deux facteurs influencent négativement sur la production de la PGase ainsi que la stabilité enzymatique (Dogan, 2008 ; Sandri et al., 2015).
La moisissure Aspergillus oryzae, cultivé en batch dans un bioréacteur air lift de 4 l sur un milieu liquide contenant du son de blé et de la pectine de citron, produit un maximum de PGase au bout de 96 h d’incubation (Fontana et al., 2009). Cependant, la moisissure Aspergillus sojae produit un maximum de PGase après 43 h de fermentation sur un milieu synthétique contenant du glucose (Dogan, 2008).
Par ailleurs, Les profils cinétiques montrent qu’il y une association entre la croissance et la synthèse de la PGase (Figure 26). Ces résultats corroborent ceux trouvés par Galiotou-Panayotou, (1998) et Sakai et Takaoka, (2014) qui montrent que la synthèse de la PGase d’A. pullulans est corrélée à la croissance. De même Bekhouche et al., (2006) indiquent que les cultures en fermenteur de 2 l à pH contrôlé de la levure Rhodotorula sp. ONRh9 produisent un maximum de cellule et de PGase après 20 h (DO, 3.96 ; PG, 0.24 U/ml) de cultures. La croissance peut être également de type non associé à la croissance comme pour certaines PGases d’autres souches fongiques (Fontana et Silveira, 2012) et bactériennes (Ur Rehman et al., 2012). D’après Buyukkileci et al., (2015) le modèle de production de la PGase dépend du type de micro-organisme, des conditions de culture et d’autres facteurs.
6.3. Evolution des glucides, des protéines et de la consommation en oxygène (PO2) Au cours de la fermentation, la consommation des glucides par la levure est rapide pendant la phase de croissance où leur concentration passe de 5.74 g/l à 1.78 g/l (Figure 27). Cependant, durant la phase stationnaire la concentration des glucides augmente et atteint une valeur de 3.4 g/l. ceci est dû certainement à la production des polysaccharides (pullulane) par A. pullulans, résultats sont confirmés par les travaux de Galiotou-Panayotou et al., (1998) qui indiquent que la PGase d’A. pullulans ATHUM 2915 est produite pendant la phase exponentielle et la phase stationnaire alors que les polysaccharides sont produites uniquement pendant la phase stationnaire.
La quantité totale de protéines est variable car il ya à la fois une consommation et une production de protéines (Figure 27). La valeur maximale de 4.46 g/l est obtenue au bout de 92 heures de fermentation. Cette augmentation se traduit par la synthèse des protéines, entre autres les enzymes.
Les conditions d'oxygène dissous jouent également un rôle de première importance dans les cultures submergées en batch pour assurer la croissance adéquate, un entretien cellulaire et une production d’enzymes pectinolytiques. Zetelaki-Horvath et Vas, (1981) et
113
Meneghel et al., (2014) ont démontré que la modification des conditions de transfert de l'oxygène dissous de la phase gazeuse à la phase liquide a une grande influence sur la production de la PGase en affectant les voies métaboliques du micro-organisme.
En effet, le taux de consommation des glucides et par conséquent la quantité de biomasse produite en fermenteur est très élevée d'environ 4 h à 32 h de fermentation. De 32 h à 52 h la consommation des glucides est ralentie. Il est à noter qu’après la phase de latence, les concentrations en oxygène dissous diminuent rapidement en raison du métabolisme microbien et sont restées à environ 30% de saturation entre 28 et 32 h de fermentation. Les concentrations en oxygène dissous montent ensuite à environ 60% et demeurent constantes jusqu'à la fin de la culture (Figure 27). La PO2 remonte lorsque la totalité du substrat est consommée par la levure (Meneghel et al., 2014). On observe que, lorsque le taux d’aération augmente dans la dernière phase de culture, une dispersion de la biomasse levurienne s’accumule sur les dispositifs métalliques de la cuve du fermenteur et un ralentissement dans la synthèse de la PGase. Ce phénomène est observé par Rattanachomsri et al., (2009) qui démontrent qu’une concentration excessive en oxygène est toxique aux levures et aux PGases produites. De plus, l’oxygénation suffisante permet d’éviter une orientation du métabolisme vers une fermentation éthanolique (Liang et al., 2014).
Conclusion partielle
Il ressort de cette étude que la levure Aureobasidium pullulans (S6) isolée d’un sol aride, est capable de se développer en conditions industrielles sur milieu optimisé à base de déchets de tomates. La synthèse de la PGase atteint sa valeur maximale après 32 heures de culture, en fermenteur de 20 l, correspondant au maximum de croissance. Ce résultat permet de décrire un mécanisme de synthèse de la PGase de type associé à la croissance. De plus, la production de la PGase, dans un temps court (32 heures de fermentation) est un facteur économiquement important pour un industriel.
Pour la poursuite de ces travaux, il serait intéressant d’approfondir l’étude par purifier et caractériser la PGase pour une éventuelle application industrielle.
114
Figure 26: Evolution cinétique de la croissance, de la production de la PGase et des glucides par la levure isolée d’un sol aride A. pullulans cultivé sur milieu optimisé à base de déchets de
tomates en fermenteur de 20 l.
Figure 27: Evolution cinétique des protéines et de la consommation en oxygène par la levure isolée d’un sol aride A. pullulans cultivé sur milieu optimisé à base de déchets de tomates en
fermenteur de 20 l. 0 5 10 15 20 25 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 A ct iv it é P G a se ( U I/ m l) B io m a ss e / G lu ci d e s (g /l ) Temps (heures)
Biomasse Glucides PGase
0 1 2 3 4 5 0 20 40 60 80 100 120 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 P ro té in e s (g /l ) P O 2 (% ) Temps (heures) PO2 Protéines
115