Partie III : Purification et caractérisation des PGases
Chapitre 3 : Résultats et discussions
3. Etude morphologique, physiologique et biochimique des souches représentatives
3.5. Caractéristiques et propriétés d’Aureobasidium pullulans
3.5.1. Caractères macroscopiques
Sur milieu MEA, YMA et PDA (Annexe 1), A. pullulans a une croissance relativement rapide. Les colonies sont plates, lisses, brillantes, levuriformes, et recouvertes d’un exsudat visqueux. La surface est de couleur rose pâle sur milieu MEA et YMA et jaune sur milieu PDA. Les colonies deviennent noires avec le vieillissement, au-delà de 7 jours (Figure 17).
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Figure 17: Caractères morphologiques de la souche S6 Aureobasidium pullulans. A : croissance d’A. pullulans sur milieu YMA, B : croissance d’A. pullulans sur milieu MEA, C : croissance d’A. pullulans sur milieu PDA, D : croissance d’A. pullulans sur milieu YPGA, E : couleur des colonies après vieillissement sur milieu YPGA.
A B
3.5.2. Caractères microscopiques Plusieurs types de morphologie
pullulans sur milieu YPGA : d
(incolores) au départ et devenant brun noirâtre avec l’
paroi plus épaisse et bien foncée produisant des arthroconidies puis des chlamydospores en vieillissant. Les blastoconidies, sont unicellulaires (de 7 à 16
ellipsoïdale, hyalines (Figure 18
bourgeonnement bipolaire et multilatéral (Figure (Annexe 1), les pseudomycéliums et les vrai 18C).
Figure 18: Morphologie microscopique de la souche YPGA et CMA. (A) : BM : bourgeonnement multilatéral,
(B) : C : conidie, BL : blastoconidie,
latérales ; (C) : S : hyphe avec des septa (vrai mycélium)
BB
A
C
86 3.5.2. Caractères microscopiques
Plusieurs types de morphologie peuvent être rencontrés chez la souche (S6 : des hyphes végétatifs de 3 à 12 µm de large, sept
(incolores) au départ et devenant brun noirâtre avec l’âge. Certains filaments présentes une paroi plus épaisse et bien foncée produisant des arthroconidies puis des chlamydospores en vieillissant. Les blastoconidies, sont unicellulaires (de 7 à 16 µm x 3,5 µm), de forme ovale, 18). La souche (S6) A. pullulans a une reproduction asexuée par bourgeonnement bipolaire et multilatéral (Figure 18 A). Sur le milieu ̋Corn meal agaȑ
les pseudomycéliums et les vrais mycéliums sont notamment observés (Figure
Morphologie microscopique de la souche (S6) A. pullulans. Culture sur milieu bourgeonnement multilatéral, BB : bourgeonnement bipolaire blastoconidie, H : hyphes avec de longues cellules conidiogènes hyphe avec des septa (vrai mycélium) ; (D) : CH : chlamydospores
BM BL C B S D S6) Aureobasidium µm de large, septés, hyalins . Certains filaments présentes une paroi plus épaisse et bien foncée produisant des arthroconidies puis des chlamydospores en µm), de forme ovale, a une reproduction asexuée par Corn meal agaȑ CMA nt notamment observés (Figure
Culture sur milieu bourgeonnement bipolaire ; hyphes avec de longues cellules conidiogènes
chlamydospores.
H
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3.5.3. Analyse phylogénétique basée sur la séquence de l’ARNr 26S et de l’ITS La séquence du gène codant pour l’ARNr 26S de la souche S6 présente 100% d’identité nucléotidique avec les séquences des souches types disponibles dans les bases de données (Figure 19 A). Par ailleurs, le séquençage de l’ITS (espaceurs internes ITS1 et 2 y compris le gène de l’ARNr 5.8S) permet d'augmenter les connaissances sur la phylogénie de l'espèce A. pullulans et d'affilier la souche S6 (A. pullulans DBVPG5844) isolée de sols de palmeraies (olivier et vigne) à cette espèce. Elle présente 100% d’identité nucléotidique avec la séquence de la souche type Aureobasidium pulluans CBS 584.75 (Figure 19 B).
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Figure 19 A: Arbre phylogénétique (Neighbour-joining) basé sur l’alignement de 550 pb des séquences nucléotidique de LSU. Les valeurs de bootstrap (100 répétitions) sont indiquées aux points de branchements. La souche isolée est indiquée en gras. La lettre "T" indique que la séquence utilisée provient de la souche type de l’espèce.
Figure 19 B: Arbre phylogénétique (Neighbour-joining) basé sur l’alignement de 550 pb des séquences nucléotidiques de l’ITS (espaceurs internes ITS1 et 2 y compris le gène de l’ARNr 5.8S). Les valeurs de bootstrap (100 répétitions) sont indiquées aux points de branchements. La souche isolée est indiquée en gras. La lettre "T" indique que la séquence utilisée provient de la souche type de l’espèce.
0.01
Aureobasidium pullulans S6 DBVPG5844
Aureobasidium pullulansvar. aubasidani CBS 100524T(FJ150952)
Aureobasidium pullulansCBS 584.75T(FJ150942) Aureobasidium pullulansCBS 146.30T(FJ150916) 100 Aureobasidium namibiaeCBS 147.97T(FJ150937) Aureobasidium melanogenumCBS 105.22T(FJ150926) 100 Aureobasidium pullulansS6 DBVPG5844 Aureobasidium pullulansCBS 584.75T(FJ150906) 97 Aureobasidium namibiaeCBS 147.97T(FJ150875) 82 Aureobasidium melanogenumCBS 105.22T(FJ150886) 100
Aureobasidium subglacialeEXF-2481T(FJ150895)
Aureobasidium microstictumCBS 114.64 (FJ150873) 0.01
3.5.4. Production de pectinase et par la souche (S6) A. pullulans
Tableau 21: Mise en évidence des activité
Activités hydrolytiques extracellulaires
Pectinase Amylase
La levure S6 soit A. pullulans pectine, de l’amidon, du lait écrémé de carbone (Tableau 21). Ce fait des protéases, des lipases et d
de ces enzymes, les recherches se sont axées sur la production de pectinases.
Conclusion partielle
La souche S6 isolée de Aureobasidium pullulans et produi
estérase. Par sa performance dans la production de pectinase, cette levure sera sélectionnée pour la suite des travaux sur la production d’enzymes pectinolytiques par culture en batch et leurs purifications et caractérisations.
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4. Production de pectinase et d’autres enzymes hydrolytiques extracellulaires
A. pullulans
Mise en évidence des activités hydrolytiques extracellulaires chez la souche A. pullulans.
Activités hydrolytiques extracellulaires
Amylase Protéase Lipase
pullulans s’est bien développée sur des milieux contenant de la ait écrémé, de la tributyrine et du Tween 80 comme unique source . Ce fait signale sa capacité à produire des pectinases, des amylases, es estérases (Tableau 21). Au vu de l’importance technologique zymes, les recherches se sont axées sur la production de pectinases.
a souche S6 isolée des sols de palmeraies (olivier et vigne) est affiliée à l’espèce et produit cinq enzymes : pectinase, amylase, protéase, lip ar sa performance dans la production de pectinase, cette levure sera sélectionnée pour la suite des travaux sur la production d’enzymes pectinolytiques par culture en batch et
actérisations.
d’autres enzymes hydrolytiques extracellulaires
s hydrolytiques extracellulaires chez la souche (S6)
Estérase
bien développée sur des milieux contenant de la , de la tributyrine et du Tween 80 comme unique source signale sa capacité à produire des pectinases, des amylases, portance technologique zymes, les recherches se sont axées sur la production de pectinases.
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