Chapitre II: Les marqueurs tumorau
II. Méthodes
II.2. Etude anatomopathologique
Le diagnostic de certitude d’adénocarcinome gastrique repose sur l’examen histologique, montrant la présence de cellules tumorales, et permettant de préciser le type histologique par analyse microscopique. C’est l’examen anatomopathologique qui permet d’établir de façon
définitive le diagnostic de l’ADK. On parle de preuve histologique.
A l’issue de l’examen anatomopathologique, le pathologiste rédige un compte-rendu où il donne les résultats et précise les caractéristiques de l’ADK. Ce compte-rendu est transmis au médecin traitant. Pour cette partie anatomopathologique nous avons procédé ainsi :
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Les prélèvements tissulaires des échantillons analysés au laboratoire sont obtenus, soit par biopsie, soit par résection d’une pièce opératoire ou des blocs communiqués.
Etape pré -analytique
Après la réception des prélèvements, nous avons enregistré les informations suivantes : -le nom du patient
-le numéro anatomopathologique -le service
II.2.1.Étude macroscopique
L’analyse macroscopique effectuée par le pathologiste donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment la taille et la localisation du cancer). Au cours de l’examen macroscopique, le pathologiste sélectionne les territoires à prélever pour l’étude microscopique : zones lésées, zones d’aspect macroscopique sain et limites de l’exérèse. La macroscopie est un diagnostic à l’œil nu où le médecin prélève un échantillon suspect et le met directement dans une cassette préalablement identifiée avec le numéro du dossier du patient pour éviter toute erreur entre les patients (Figure 08). Cette étape se fait dans la salle de macroscopie où tous les prélèvements reçus se préparent sous l’hôte aspirante.
Figure 08: La mise en place des fragments dans une cassette et la numération II.2.2. Etude histologique
II.2.2.1. Préparation des échantillons pour l’étude microscopique
L’étude microscopique se fait sur des préparations tissulaires qui subissent des transformations ; elle est divisée en plusieurs étapes :
Etape 01: Fixation
La fixation est indispensable pour conserver la morphologie cellulaire. Elle doit être effectuée immédiatement après l’obtention du prélèvement. Son pour but est de s’opposer à l’autolyse prématurée des cellules responsable de la putréfaction des tissus, et garantir la
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conservation des structures des prélèvements dans un état proche de l’état vivant. La durée de fixation indispensable, des pièces opératoires est de 24h minimum; pour les biopsies c’est 6h. Toute fixation défectueuse rend l’étude anatomopathologique difficile voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu). A cet effet,
Le volume de fixateur doit représenter environ 10 fois le volume de la pièce. Le fixateur utilisé : est une solution de formol à 10 % tamponné.
La cassette est mise dans 02 bains de la solution de formol (30 min pour chacun).
Etape 02: Circulation des tissus
Elle comporte 03 étapes essentielles : Déshydratation
L’échantillon est progressivement déshydraté par passages successifs dans des solutions alcooliques de plus en plus concentrées : 05 bains de degrés croissants : (75%, 80%, 90%, 95%, et 100% pendant 02h pour chaque bac d’alcool) jusqu’à ce que toute l’eau (des tissus et du milieu de fixation) ait été soustraite et que l’échantillon soit totalement imprégné d’alcool absolu. (Figure 09).
Eclaircissement
L’alcool est ensuite remplacé par un solvant organique de la paraffine dans lequel peuvent se dissoudre à la fois l’alcool et la paraffine (la paraffine n’est pas soluble dans l’eau). Donc l’alcool est chassé par 03 bains successives de xylène (02h, chacun). Ce dernier va rendre le tissu transparent(Figure 09) .
Imprégnation
Nous avons imprégné l’échantillon ou l’enrobé dans la paraffine liquide (02 passages pendant 02h puis 03h successivement) ce qui va durcir le prélèvement cela nous a permis d’obtenir une pièce qui ne contient ni eau, ni alcool, ni solvant intermédiaire(Figure 09) .
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25 Figure 09: Automate Histokinette permettant l’inclusion des échantillons fixés dans de la
paraffine après déshydratation.
Etape 03: Inclusion en paraffine chauffée
L’échantillon est ensuite immergé dans de la paraffine chauffée à une température dépassant juste son point de fusion, puisque celle-ci est solide à température ambiante.
Cette étape ne peut être réalisée que si la pièce est complètement déshydratée et elle est réalisée grâce à un automate d’inclusion qui se charge de la mise à disposition d’un bloc de paraffine prêt à être couper.
La pièce est mise dans un moule en acier inoxydable déposé sous un robinet qui sert à verser de la paraffine chaude (70°C). Puis le moule est mis dans une chambre froide (-0°C) pour que la paraffine se solidifie rapidement et la pièce sera incluse parfaitement là-dedans (Figure 10 (a)).
Il faut bien appuyer sur la pièce pour la fixer dans le fond du moule et pour qu’elle soit couverte complètement par la paraffine (Figure 10 (b)).
Pour identifier le bloc, nous avons remet la cassette sur le moule, avant que la paraffine ne soit complètement refroidie (Figure 10 (c)).
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26 Figure 10: Inclusion de la pièce dans les moules dans la paraffine chaude. (a) : La pièce est
mise dans un moule en acier inoxydable, (b) : la pièce est dans la paraffine chaude, (c) : la remise de cassette sur le moule.
Refroidissement
Une fois l’échantillon bien imprégné, nous l’avons laissé refroidir dans un congélateur pour quelques minutes (-60°C), cela permet de renforcer leur solidité et faciliter leur coupe (Figure 11).
Figure 11: Refroidissement des pièces et obtention des blocs solides de paraffine.
Etape 04 : Réalisation de coupes
Après refroidissement, le fragment, imbibé de paraffine, se trouve inclus dans un bloc solide à partir duquel, grâce à un microtome comportant un rasoir, nous avons réalisé des coupes de 05 microns d’épaisseur qui sortent en formant un ruban ( Figure 12) .
c
b
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27 Figure 12: Obtention des coupes sous forme d’un ruban.
Les coupes sont par la suite recueilliées sur lames de verre après les avoir mis dans un bain marie qui va faciliter leur étalement sur les lames (Figure 13). Ces dernières sont numérotées et mises dans l’étuve (1h30/ 48-57°C) pour augmenter l’adhésion des rubans tissulaires sur la lame et les déparaffiner.
Figure 13: Etalement des coupes sur la lame.
Etape 05 : La coloration des coupes par Hématoxyline-Eosine (HE)
Les tissus de l'organisme ne sont pas spontanément colorés, ce qui rend les observations difficiles. Les colorants utilisés en histologie sont plus ou moins sélectifs ; la plupart sont des composants acides ou basiques en milieu aqueux qui forment des sels avec les radicaux
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ionisés des tissus. Des composants acides sont utilisés pour les zones tissulaires basophiles et des composants basiques sont utilisés pour les zones tissulaires acidophiles.
Dans notre cas, la coloration est réalisée par l’hématoxyline Eosine (HE) où L'hématoxyline est une substance basique, qui colore les noyaux en violet. L'éosine est une substance acide, qui colore les cytoplasmes en rose. Cette coloration nécessite :
Réhydratation
Pour que l'on puisse utiliser une coloration, la paraffine doit être éliminée. On procède donc au déparaffinage, qui consiste à passer les lames dans des bains de xylène afin de dissoudre la paraffine. On effectue ensuite une réhydratation : l'alcool se mélange avec l'eau et le xylène, on passe les lames dans des bains d'alcool de degré décroissant (de 100°, 95°, 90°, 80°, 75°C). Les étapes de réhydratation et coloration ont été réalisés par un automate de coloration (Figure 14), les étapes sont les suivantes :
Nous avons mis les lames dans un bain de xylène pur pendant 18 min, pour éliminer la paraffine
puis dans l’éthanol à degré décroissant (18 min) pour la réhydratation
puis nous avons procédé à un lavage avec de l’eau distillée
ensuite dans l’hématoxyline (06 min) pour colorer le noyau
puis nous avons effectué un lavage avec l’eau distillée
puis dans l’éosine (02 min) pour colorer le cytoplasme
un lavage avec l’eau distillée a été réalisé
et enfin dans l’éthanol pendant 06min, pour terminer dans le xylène (15 min) pour l’éclaircissement.
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Montage
Après séchage des lames, les étalements tissulaires sont montés entre lame et lamelle avec résine synthétique dont l’indice de réfraction est voisin de celui du verre.
Ces lames sont numérotées et prêtes à être observer à l’aide du microscope optique (Figure 15).
Figure 15: étapes de montage des lames. II.2.2.2.Etude microscopique
Après le montage, les lames ont était lues et interprétées en présence du médecin anatomopathologiste sous microscope photonique qui permet l’enregistrement de l’image observée. Au début on utilise un faible grossissement pour la capture d’une bonne image de la tumeur, puis on passe au fort grossissement pour mieux analyser les détails de la tumeur (cellulaire et nucléaire). Une bonne lecture des lames est indispensable pour un diagnostic précis du stade et de grade de la tumeur (Figure 16).
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30 Figure 16: Visualisation des lames sous microscope optique (Grossicément 40)
Etape analytique
II.2.3. Immunohistochimie (IHC)
L’IHC consiste à mettre en évidence certaines protéines cellulaires, qu'elles soient cytoplasmiques, membranaires ou nucléaires, spécifiques pour un type ou une fonction cellulaire, à l'aide d'une réaction antigène – anticorps. Le complexe formé étant rendu visible, donc localisable, par un marqueur fluorescent ou enzymatique fixé directement ou indirectement sur l’anticorps. L’IHC est réalisée en premier lieu, seul les cas douteux (IHC2+) sont vérifiés par HIS. Dans notre travail, la recherche du profil HER2 est faite seulement par IHC et elle était suffisante dans 100% (30 cas).
Cette technique se réalise à la demande de l’anatomopathologiste. Son but est d’aider au diagnostic dans les cas difficiles et de déterminer la thérapeutique adéquate.
II.2.3.1.Les différentes étapes de la technique d’immunohistochimie
III.2.3.1.1.Réalisation des coupes
Nous avons donc réalisé des nouvelles coupes à partir des blocs de paraffine sélectionnés par le pathologiste. Le microtome est ainsi réglé pour obtenir des échantillons d’une épaisseur de 4 à 5 μm, les coupes obtenues ont été étalées dans un bain marie puis recueillies sur des lames spéciales (les lames silanisées) pour une meilleure adhésion et éviter le découlement
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des étalements lors de la manipulation. Les lames sont par la suite mises dans l’étuve à 37°C pendant 24h pour leur séchage.
II.2.3.1.2.Déparaffinage et réhydratation (Figure 17)
- Les lames sont mises dans le xylène pur (15 min) pour éliminer l’excès de la paraffine. - Les lames sont mises ensuite dans l’alcool pur (15 min) la réhydratation.
- Puis, elles sont mises dans l’eau distillée (10 min) pour le rinçage .
Figure 17: Les lames sont mises dans les 03 becs de : xylène, alcool et eau distillée
successivement.
II.2.3.1.3. Démasquage nous l’avons réalisé comme suit :
mettre la solution de démasquage TRS (traget retrieval solution) à pH 6 déjà préparée (elle va être diluée à 1/10 dans l’eau distillée) dans le bain marie à 93°C ;
mettre les lames dans la solution de démasquage et les porter au bain chaud (dit à la cocotte-minute) pendant 40 minutes ; (cette solution permet de révéler les antigènes masqués par des molécules antagonistes) (Figure 18) .
sortir les lames du bain marie et laisser refroidir sur la paillasse dans la solution de démasquage pendant 20 minutes.
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32 Figure 18: mettre les lames dans la solution de démasquage
Après séchage des lames, nous avons (avec l’aide de médecin) dessiné sur la lame, un cercle autour de la zone fixée avec le crayon hydrophobe (DakoPen) pour faciliter le dépôt de l’AC primaire en limitant la zone de diffusion des solutions d’immunohistochimie sur le prélèvement et éviter toute déperdition et contamination des colorations (Figure 19).
Figure 19: Traçage avec le Dako Pen.
II.2.3.1.4.Blocage de peroxydase endogène
Pour réduire la coloration de fond indésirable dans l'IHC causée par l'activité de la peroxydase endogène, la solution de blocage ( Dual Endogenous Enzyme Block ) est appliquée sur la coupe tissulaire.
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L’ajout de la solution de blocage Dual Endogenous Enzyme lock (peroxydase+ eau oxygénée (H2O2)) sur la zone limitée par le Dako Pen (10-15min) où le peroxyde d'hydrogène (H2O2) contenu dans la solution inactive ou empêche l'activité de la peroxydase endogène (Figure 20).
Rinçage des lames avec l’eau distillée puis P S (Phosphate uffered Saline) pendant 5 minutes (Figure 20).
Figure 20 : L’ajout de la solution de blocage Dual Endogenous Enzyme lock et le rinçage
avec le PBS.
II.2.3.1.5.Marquage à l’anticorps primaire
Le marquage est réalisé en déposant quelques gouttes de l’anticorps primaire anti- HER2 (Figure 21), et le laisser par la suite incuber pendant 30 minutes. A la fin nous avons effectué un rinçage dans deux bains de solution PBS (2x5 min).
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34 II.2.3.1.6.Traitement par l’anticorps secondaire
Cette étape est effectuée comme suit :
- Dépôt de l’AC secondaire polymère marqué pour recouvrir l’échantillon (Figure 22). - Incubation pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.
- rinçage avec l’eau distillée puis le T S (2x5 min).
Figure 22: Dépôt de l’AC secondaire.
II.2.3.1.7.Application de chromogène
Pour recouvrir l’échantillon (L’activation enzymatique du chromogène génère un produit de réaction visible au niveau du site antigénique, coloration ou positivité marron) nous avons appliqué suffisamment la solution de substrat chromogène de la peroxydase DAB (3-3 Diamino Benzidin) (Figure 24). Ensuit incuber pendant 10 minutes puis Rinçage à l’eau distillée.
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Figure 23 : Application de (DAB Chromogène) sur les lames et apparition des taches marron
résultants de la réaction enzymatique entre la peroxydase et le chromogène DAB.
II.2.3.1.8.Contre coloration
Elle est réalisée par immersion de bac des lames dans l’hématoxyline de MAYER aqueuse qui va colorer le noyau (Figure 24), puis mettre en incubation pendant 5 minutes. A la fin nous avons rincé successivement à l’eau distillée, solution ammoniaque puis à l’eau distillée.
Figure 24 : Immersion de bac des lames dans l’hématoxyline de MAYER aqueuse.
II.2.3.1.9.Montage
Le Dako faramount aqueous mounting medium (01 goutte) est utilisé sur la lame (Figure 25), cette dernière est couverte ensuite avec une lamelle pour l’observation microscopique.
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36 Figure 25 : ajout de solution de montage.
Notons que toutes les incubations ont été faites à température ambiante en chambre humide.