Etude du rôle pronostique de la protéine HER2 dans le cancer gastrique

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE AKLI MOHAND OULHADJ – BOUIRA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET DES SCIENCES DE LA TERRE DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Réf : ……./UAMOB/F.SNV.ST/DEP.BIO/2017

MEMOIRE DE FIN D’ETUDES

EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME MASTER

Domaine : SNV Filière : Sciences Biologiques

Spécialité : Analyses biologiques et biochimiques

Présenté par :

M

HAMICHI Sabrina & M

HELLAL Amina

Thème

Etude du rôle pronostique de la protéine HER2 dans le

cancer gastrique

Soutenu le : 02 / 07 / 2017

Devant le jury composé de :

Nom et Prénom Grade

M. LEBDIRI Farid MAA Univ. de Bouira Président Mme. CHERIFI Zakia

M.CHERGUI Achour MAA MAA Univ. de Bouira Univ. de Bouira Promotrice Co-promoteur M. BOUTELJA Razika MAA Univ. de Bouira Examinatrice

Remerciement

Je remercie d’abord ALLAH le tout puissant qui m’a guidé et qui nous a donné la force et la volonté de réaliser ce travail.

Au terme de ce travail, il nous est très agréable d’exprimer toute notre gratitude, notre reconnaissance et nos très vifs remerciements à Madame CHERIFI.Zakia, d’avoir accepté de diriger ce travail et pour son entière disponibilité et son efficacité, pour nous avoir fait partagée son expérience, pour son aide permanente sur tous les plans, pour les conseils et les encouragements qu’elle a su nous les prodiguer pendant toute la durée de ce mémoire.

Nos remerciements vont également à M .Chergui A. Co-promoteur, d’avoir accepter de participer à notre encadrement, qu’il trouve ici nos sincères gratitudes.

Je tiens à remercie l’ensemble des membres du jury d’avoir accepté d’examiner ce travail, et tout particulièrement. Monsieur LABDIRI.Fqui nous a fait honneur d’accepter de présider

notre jury de soutenance et Madame BOUTELDJA.R qui a accepté de juger ce travail. Nous leur sommes très reconnaissants d’y avoir consacré

Une partie de son temps si précieux.

Nous exprimons nos sincères remerciements, au docteur BENHMED.Meriem qui nous a accueillis au niveau du laboratoire d’anatomopathologie de Centre Pierre et Marie Curie

d’Alger.

Ainsi que toute l’équipe de services d’anatomopathologie et plus particulièrement, Djazira qui nous aide à réaliser les techniques utilisées dans cette étude.

Que nous collègues trouvent ici toute notre reconnaissance pour le temps passé en leurs compagnies.

Dédicace

Je dédie ce modeste travail

A mon très cher Père

A celui qui m'a indiqué la bonne voie en me rappelant que la

volonté fait

toujours les grands hommes

Aucune dédicace ne saurait exprimer l’amour, l’estime, le

dévouement et le respect que j’ai toujours

eu pour toi. Rien au monde ne vaut les efforts fournis jour et nuit

pour mon éducation et mon bien être.

Ce travail est le fruit de tes sacrifices que tu as consentis pour mon

éducation et ma formation.

Je t’aime Papa

A ma très chère mère

Autant de phrases aussi expressives soient-elles ne sauraient

montrer le degré d’amour et d’affection que j’éprouve pour toi. Tu

m’as comblé avec ta tendresse et affection tout au long de mon

parcours.

Tu n’as jamais cessé de me soutenir et de m’encourager durant

toutes les années de mes études, tu as toujours été présente à mes

côtés pour me consoler quand il fallait. En ce jour mémorable,

pour moi ainsi que pour toi, reçoit ce travail en signe de ma vive

reconnaissance et ma profonde estime. Puisse le tout puissant te

donner santé, bonheur et longue vie afin que je puisse te combler à

mon tour.

je t’aime Maman

à ma chère binôme Sabrina et sa famille

Pour toutes les personnes qui ont été toujours près de moi, merci

pour vos encouragements, soutient et amour Surtout Dounia,

Akila , Mimi , Razika .

Je vous aime

Dédicace

Je dédie ce modeste travail

A mon père pour l’éducation qu’il m’a donné, tous les principes

inculqués, l’amour et le soutient qu’il ne cesse de m’apporter. Qu’il

trouve ici l’expression de mon amour absolu et inconditionnel.

A ma défunte mère qui durant toute mon existence m’a toujours

entouré de tendresse, même après sa disparition son souvenir ne

cesse de me combler de toute l’affection maternelle, je lui dois la vie

et ce que je suis devenue, elle m’a apporté rigueur et discipline

qu’elle repose en paix.

A mes frère, Mohammed, Saïd et sa femme fatima,Omar,

et mon cher frère Noureddine, qui sont toujours présents pour moi

dans ma vie.Qu’ils trouvent ici le témoignage de mon amour et

mon respect.

A mes sœur, Dalila, Fozia, Malika, Nacira et son mari

Ibrahim et ces fils Mohammed Anes et Abdelkarim, qui sont

la joie de notre maison. Qu’ils trouvent ici un symbole du respect

que je les portes.

A mes oncles et tantes. Qu’il trouve ici mon respect.

A ma sœur et mon amie Chahira.

A mon binôme Hellal Amina et sa famille.

A mes plus chère amies : Khadidja, Assia, Dounia,

Chafiâ, pour leur amitié et leur soutient.

A Samia la technicienne de laboratoire au niveau de

l’université de Akli Mohand Oulhadj de Bouira pour sa

précieuse aide durant toutes mes années d’études.

A touts les membres de ma promotion.

A toutes les personnes qui ont croisé ma route et qui ont contribué

à ce que je devienne quelqu’un de meilleur.

Sabrina

Liste des abréviations

Liste des abréviations

Ac : Anticorps

ACE : Antigène Carcino-Embryonnaire

ADCC: Antibody Dependant Cell mediated Cytotoxicity

ADK : Adénocarcénome

ADN: Acidedésoxyribonuclique

°C: degré Celsius

CA19-9 : Antigène Carbohydrate 19-9

CPMC : Centre Pierre et Marie Curie

DAB: 3-3 DiaminoBenzidine

EGFR: EpidermalGrowth Factor Receptor

ErbB: Growth factor ReceptorBindingprotein

ESMO: European Society for MedicalOncology

FU: Fluoropyrimidine

GIGA: Gastro-Intestinal Carbohydrate Antigen.

h: heure

HE: Hématoxyline Eosine

HER2: Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, (récepteur 2 du facteur de croissance

épidermique humain).

HIS: HybridationIn Situ

H. pylori: Helicobacter pylori

IHC: Immunohistochimie

Liste des abréviations

MAP kinase: MitogenActivatedProtein Kinase

min: minute

OMS : Organisation Mondial de Santé

PBS: Phosphate Bufferd Saline

PM: Poids Moléculaire.

PI3K: Phosphatidyl inositol 3-OH kinase

TNM: Tumor Nodes Metastase

TRS: Traget Retrieval Solution μm : micomètre

Liste des figures

Listes des figures

Figure 1: Anatomie et histologie de l’estomac………..…………4

Figure 2: La localisation du récepteur HER2 sur le chromosome 17………..10

Figure 3: La structure schématique des récepteurs de la famille ErbB…………...………….11

Figure 4: surexpression du récepteur HER2 due a une amplification génique………..……..12

Figure 5: Algorithme des tests pour la détection du marqueur Her2 dans le cancer de l’estomac…………..……….13

Figure 6: Mécanismes d’action du Herceptine (trastuzumab)…………..………...14

Figure 7: Diagramme général de plan de travail………..………....15

Figure 8: La mise en place des fragments dans une cassette et la numération………....22

Figure 9: Circulation des tissus………..……….…….24

Figure 10: Inclusion de la pièce dans les moules dans la paraffine chaude ………...…25

Figure 11: Refroidissement des pièces et obtention des blocs solides de paraffine…………25

Figure 12: Obtention des coupes sous forme d’un ruban………26

Figure 13: Etalement des coupes sur la lame………...………26

Figure 14: Automate de coloration………..………27

Figure 15: Etapes de montage des lames………...………..28

Figure 16: Visualisation des lames sous microscope optique………..29

Figure 17: Les lames sont mises dans les 03 becs de : xylène, alcool et eau distillée successivement………..………23

Figure 18: mettre les lames dans la solution de démasquage……….…….31

Figure 19: Traçage avec le Dako Pen………...………32

Figure 20: L’ajout de la solution de blocage Dual Endogenous Enzyme Block et le rinçage avec le PBS………..……….33

Figure 21: Le dépôt de l’AC primaire………..33

Figure 22: Dépôt de l’AC second..………..34

Figure 23: Application de (DAB Chromogène) sur les lames et apparition des taches marron résultants de la réaction enzymatique entre la peroxydase et le chromogène DAB………….35

Liste des figures

Figure 24: Immersion de bac des lames dans l’hématoxyline de MAYER aqueuse………..35

Figure 25: Ajout de solution de montage………...….36

Figure 26: l’automate Elecsys 1010/2010 et MODULAR ANALYTICS E170 …………....37

Figure 27: le principe ELICA sandwich………..…38

Figure 28: La répartition selon la tranche d’âge………...………39

Figure 29: La répartition selon le sexe……….40

Figure 30: La répartition selon l’âge………..……..41

Figure 31: Réparation selon le sexe……….…………42

La Figure 32: répartition selon la nature de prélèvement………….………...…43

Figure 33: La réparation selon la taille tumorale……….………44

Figure 34: La répartition selon la classification pTNM……….………..45

Figure 35: La répartition selon le type histologique………46

Figure 36: La répartition des différents patients en fonction de grade histologique……..….47

Figure 37: La réparation selon le siège………..………..48

Figure 38: Cas d’adénocarcinome gastrique papillaire observé sur les lames histologiques de nos patients…………...……….49

Figure 39: Cas d’adénocarcinome gastrique tubuleux observé sur les lames histologiques de nos patients………...……….50

Figure 40: Cas d’adénocarcinome gastrique mucineux observé sur les lames histologiques de nos patients………51

Figure 41: Cas d’adénocarcinome gastrique à cellules indépendantes observé sur les lames histologiques de nos patients……….52

Figure 42: La répartition de la surexpression de l’HER2 selon les scores……….……..53

Figure 43: Absence de surexpression de l’HER2 score0……….………54

Figure 44: Absence de surexpression de l’HER2 score1+………..54

Liste des tableaux

Liste des tableaux

Tableau I: La corrélation entre l’expression de statut HER2 et les paramètres

clinicopathologiques………...15

Tableau II: La corrélation entre le récepteur HER2 et les paramètres

clinicopathologiques...55

Table des matières

Table de matières

Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux

Introduction……….1

Chapitre I Généralité

III-Les facteurs de risques………..5

IV. Manifestations clinique du cancer gastrique………6

V-Diagnostic………..7

VI-Classifications de cancer gastrique………..8

VI.1. Classification histologique de l’OMS……….8

VI.2. Classification pTNM des adénocarcinomes de l’estomac………...9

Chapitre II: Les marqueurs tumoraux

I.1.Définition………...10

I.2.Structure du récepteur HER2……….10

I.3.Mécanisme d’activation……….11

I.4.Oncogène cellulaire………...11

I.5.HER2 et le cancer gastrique………..12

I.6.Indication………...12

I.8.Méthodes de détermination du statut HER2………..13

I.9.Les principales voies de signalisation………16

II. Traitement……….16

Table des matières

II-2 La chimiothérapie………17

II-3 La radiothérapie………...17

II-4 La thérapie ciblée……….17

III. La surveillance………...18

III.1.Les marqueurs tumoraux sériques………..19

Partie expérimentale

I-1- Milieu et période d’étude……… ...20

I-2- Le principe de l’étude……….20

I.3. Matériel et réactifs………...20

II. Méthodes………22

II.1.Etude rétrospective………..22

II.2. Etude anatomopathologique………...22

II.3.Dosage des marqueurs tumoraux sériques dans la surveillance………..36

I.Analyse statistique……….38

Résultats et discutions

I.1.L’échantillon de 70 cas………...39

I.2.l’échantillon de 30 cas………..41

II. Etude anatomopathologique………...46

II.1.Répartition de l’échantillon selon les résultats de l’étude histologique coloration HE……….. ..46

II.2. L’immunohistochimie (IHC)………. 51

Table des matières

Conclusion………..58 Références bibliographiques………..59 Annexes

Introduction

1

Le cancer de l’estomac représente un véritable problème de santé Publique, puisqu’il demeure la deuxième cause de décès par cancer dans le monde (Giovannini, 2012).

Le cancer gastrique est unetumeur qui se forme dans les tissus qui tapissent l'estomac. La plupart d’entre elle se développe à partir de cellules de la couche interne. Ces cancers sont appelés adénocarcinomes et représentent environ 90 % des cancers de l'estomac (ESMO, 2012).

L’HER2 est une tyrosine kinase membranaire, lorsqu’elle est surexprimée dans certains cancer de l’estomac, elle fournit à la cellule tumorale de puissants signaux prolifératifs et antiapoptotiques (Goura, 2012). La surexpression de l’HER2 a été détectée dans plusieurs cancers, elle est décrite dans 10 à 30% des adénocarcinomes gastriques (El Fatemi, 2012). Le statut HER2 peut être évalué par Immunohistochimie (IHC) et/ou par hybridation in situ (HIS). La technique d’IHC est suffisante pour déterminer le statut HER2 des tumeurs dans environ 90 % des cas (Penault-Llorcaet al, 2012). L’immunohistochimie est recommandée comme le premier test, elle permet de visualiser le récepteur sur la membrane cytoplasmique des cellules tumorales (Monges, 2011). Un statut HER2 positif est un facteur de mauvais pronostic mais constitue un facteur prédictif de la réponse au traitement de l’herceptine.

L’antigène carbohydrate 19-9 (CA19-9) est un antigène polysaccharidique, décrit pour la première fois en 1979, qui joue un rôle important dans l’adhésion des cellules cancéreuses à l’endothélium (Chaussadeet al,2012).

L’objectif de notre travail vise à établir la prévalence de l’expression de récepteur HER2 dans le cancer gastrique dans chez des patients algériens, par la technique d’immunohistochimie, afin de sélectionner les patients pour le traitement par l’Herceptine, suivre la réponse post chimiothérapique, et d’étudier la corrélation entre la surexpression de HER2 et les paramètres clinicopathologiques.

Notre travail comprend deux parties. La première est une synthèse des connaissances bibliographiques porte sur l’étude de cancer gastrique. La deuxième correspond à notre étude réalisée au niveau de deux services d’anatomopathologie et de biochimie du Centre Pierre et Marie Curie d’Alger, notre travail comprend trois parties, la première est une consultation de 70 dossiers des patients atteints d’adénocarcinome gastrique colligés au niveau du CPMC, la

Introduction

2

deuxième est une étude anatomopathologique qui se divise en deux partie , étude histologique, et une étude immunohistochimique, et la dernière est une technique de dosage du marqueur tumoral Ca19-9.

Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités

3 I. Estomac

I.1.anatomie de l’estomac

L’estomac est la portion du tube digestif en forme de poche, située entre l’œsophage et le duodénum, il permet d’assurer la digestion par ses fonctions mécaniques (ondes de brassage) et chimiques en mélangeant les aliments aux sucs gastriques (eau, acide chlorhydrique, enzymes). C’est ainsi que le bol alimentaire se transforme en une bouillie visqueuse appelé chyme gastrique, qui se déverse dans le duodénum via le pylore (Jean, 2014). Elle a une dimension de 125cm, soit 25 à 28cm de longueur, 10 à 12 cm de largeur et 8 à de diamètre antéropostérieur. Sa capacité étant de 600 à 2000 cm3 (Goura, 2012).

L’estomac est composé de quatre régions :

• le cardia est la zone de jonction entre l’œsophage et le reste de l’estomac. Il se ferme lorsque l’estomac est plein pour empêcher son contenu de refluer.

• le fundus correspond au renflement supérieur de l’estomac. Il contient toujours de l’air. • le corps de l’estomac proprement dit.

• l’antre pylorique forme l’extrémité inférieure de l’estomac : elle se termine par le pylore, un sphincter qui s’ouvre et se ferme automatiquement pour laisser passer des fractions du bol alimentaire (Taieb, 2014) (Figure 1).

I-2-Histologie de l’estomac

La paroi gastrique est formée par quatre couches, on y distingue de la profondeur vers la superficie

• la couche muqueuse, la plus interne, sécrète les sucs gastriques nécessaires à la digestio • la couche sous-muqueuse comporte les vaisseaux sanguins, les vaisseaux lymphatiques et les nerfs nécessaires au fonctionnement de l’estomac

• la couche musculaire permet à l’estomac de se contracter pour assurer ses fonctions • la couche séreuse, externe, délimite les contours de l’estomac (Taieb, 2014) (Figure 1).

Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités

4

Figure 01 : Anatomie et histologie de l’estomac (ESMO, 2012). I-3-Cancer de l’estomac

Le cancer de l'estomac ou adénocarcinome gastrique (adenoépithéluma) est une forme de cancer se développant aux dépens des tissus de l'estomac. Il se développe à partir des ulcérations des cellulaires de la muqueuse gastrique et peut se développer à la surface de la muqueuse épithéliale ou en profondeur dans la paroi gastrique et la perforer (Nshizirungu, 2014).

II-Epidémiologie

II-1-Fréquence

Le cancer de l’estomac occupe le quatrième rang des cancers (après celui du poumon, du sein et le cancer colorectal) et la deuxième cause de mortalité par cancer après celui du poumon (Gaouzi, 2015).

Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités

5

L’incidence des cancers de l’estomac dans le monde est estimée à 1 millions de nouveaux cas par an (Gaouzi, 2015). Il demeure l’un des cancers les plus fréquemment diagnostiqués à travers le monde, (Goura. 2011) La répartition mondiale est inégale avec une prévalence plus élevée dans les pays d’Asie de l’Est, d’Europe de l’Est et d’Amérique du Sud (Soularue, 2014). Les régions d’incidence moyenne sont l’Amérique du nord et l’est de l’Europe (Goura. 2011) par contre les zones a risque faible, sont l’ USA, la France, l’Australie et l’Afrique du nord et de l’est (Gaouzi, 2015).

En Algérie, le cancer de l’estomac vient en cinquième position avec 1430 cas chaque année, soit 5% précède du cancer du sein, du cancer colorectal, celui de poumon et de la vessie (Salmi, 2014)

II-3- Le sexe

Il est caractérise par une Prédominance masculine avec un sexe ratio de 2 (Peghini et al ,1997)

II-4- L’âge

Le cancer de l’estomac surviennent rarement avant l’âge de 40 ans .L’incidence augmente rapidement plus de 60% des patients atteints de ce cancer ont plus de 65ans (Salmi, 2014)

II-5-Siège

Le cancer de l’estomac siège dans 60% dans la région antrale, 20% dans le grande courbure, faces et cardia, 20%dans la petite courbure (Goura. 2011) .

II-6-survie

La survie est de 10-15%tout stade confondu (Goura. 2011) .

III-Les facteurs de risques

ESMO, (2012) indique qu’aujourd’hui, les causes d’apparition du cancer de l’estomac sont mal élucidées. Certains facteurs de risque ont néanmoins été identifiés. Un facteur de risque augmente le risque d’apparition du cancer mais il n’est pas déterminant n’est ni suffisant ni nécessaire pour provoquer le cancer. Ce n’est pas une cause en soi. Les principaux facteurs de risque du cancer de l’estomac :

Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités

6 Certaines affections de l’estomac peuvent favoriser la survenue d’un cancer (Rougier et al.,

2016). Helicobacter pylori (H. pylori est une bactérie gram négatif micro-aérobique spirale (Braham ,1991), qui peut infecter la muqueuse de l’estomac et causer une inflammation chronique ou des ulcères d'estomac (ESMO, 2012).

Les facteurs d’environnement tel le tabac, la consommation de sel et la quantité de la substance anti-oxydante présente dans les aliments, sont capable d’interférer avec H.pylori et de moduler le risque de cancer (Bretagne, 2003).

Les ouvriers de l’industrie du charbon, des métaux et du caoutchouc semblent présenter un risque légèrement plus élevé de développer un cancer de l'estomac.

III.5.Les facteurs qui ne sont pas modifiables

ESMO (2012) présente plusieurs facteurs qui peuvent augmenter le risque de cancer de

l'estomac

 Une mutation héréditaire

La molécule d'adhésion cellulaire E-cadherine joue un rôle clé dans l’établissement et maintenance de la structure des tissus épithéliaux (Mayer et al., 1993). La mutation de gène qui code pour cette protéine conduit à un risque très élevé de développer un cancer de l'estomac (ESMO, 2012).

 Un antécédent de cancer de l'estomac

Chez un parent du premier degré (parents, frères, sœurs ou enfants) augmente le propre risque de développer la maladie.

 Pour des raisons inconnues

Les personnes du groupe sanguin A ont plus de risques de développer un cancer de l'estomac.

 Le sexe

Le cancer de l'estomac est plus fréquent chez les hommes que chez les femmes, les raisons de cette différence sont incertaines, mais les œstrogènes, des hormones sexuelles femelles, pourraient avoir un effet protecteur.

 Un antécédent d’intervention chirurgicale sur l'estomac

Quand une partie de l'estomac a été enlevée, par exemple en raison d'un ulcère gastrique, il existe un risque plus élevé de développer un cancer dans la partie restante.

IV. Manifestations cliniques du cancer gastrique

La symptomatologie clinique du cancer gastrique est discrète, le plus souvent tardive et aspécifique, témoignant d’une maladie déjà localement avancée ou métastatique. Les tumeurs

Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités

7

débutants sont habituellement asymptomatiques et rarement détectées en dehors d’une politique de dépistage ciblée. Les premières manifestations cliniques sont banales et n’inquiètent pas le patient .Une perte de poids et des douleurs abdominales représentent les symptômes les plus fréquents lors du diagnostic initial (Salmi, 2014). Lorsqu’elle est plus évoluée, la tumeur peut engendrer d’autres signes : des vomissements, une hémorragie et donc une anémie .La perforation de l’estomac est une complication possible qui peut révéler la maladie (Taieb, 2014).

V-Diagnostic

Un diagnostic précoce de cette maladie est difficile, car la plupart des patients restent

longtemps asymptomatiques (El fatemi et al., 2012).

V-1- Clinique

Taieb (2014) montre que l’examen clinique permet de repérer les signes généraux comme l’amaigrissement, les douleurs épigastriques. Lorsque la maladie est évoluée, le médecin peut identifier d’autres signes cliniques, tels qu’une masse importante au niveau de l’estomac propagation du cancer aux ganglions lymphatiques situés dans cette zone (ESMO, 2012). Si le médecin suspecte un cancer gastrique, il proposera la réalisation d’une endoscopie (Taieb, 2014).

V-2-Endoscopie

Cet examen permet d’examiner l’intégralité de la surface interne du système digestif haut

(oesophage, estomac, duodénum) afin d’y repérer la présence d’éventuelles lésions, il permet le diagnostic dans 95% des cas (Gaouzi, 2015). Il consiste à introduire un mince tube flexible émettant de la lumière, appelé endoscope, par la gorge du patient, jusqu'à l'estomac (ESMO ,2012).Le système optique est couplé avec des instruments qui permettent de réaliser de petits prélèvements (biopsie) si une lésion suspecte est découverte suite à l’endoscopie, les biopsies sont analysées (Taieb, 2014) au laboratoire par un anatomopathologiste. C'est ce qu'on appelle un examen anatomopathologique. Au moyen d’un microscope et d’autres tests (ESMO, 2012) qui permet de savoir si les cellules composant la lésion détectée sont normales ou cancéreuses (Taieb, 2014).

V.3. Le bilan d’extension

Lorsque le diagnostic de cancer gastrique est confirmé, il faut évaluer dans quelle mesure le cancer s’est étendu au reste de l’organisme. C’est ce qu’on appelle un bilan d’extension, il permet de déterminer quel sera le traitement le plus approprié pour le patient.

Ce bilan débute avec un interrogatoire et un examen clinique standard. Un scanner de l’ensemble du tronc est ensuite systématiquement réalisé (Taieb, 2014). Cet examen

Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités

8

d’imagerie apporte des informations sur la position de la tumeur au sein de l’estomac et l’extension métastatique au niveau des organes voisins (foie, poumon...) (Rougier, 2016). Par la suite, en fonction de la nature et de l’extension de la tumeur décelée, d’autres examens spécifiques pourront être prescrits. Une analyse de sang est ainsi souvent réalisée pour doser des marqueurs tumoraux spécifiques (CA19-9, ACE) dont le suivi sera ensuite utile pour apprécier l’efficacité du traitement (Taieb, 2014).

VI-Classification de cancer gastrique

VI.1. Classification histologique de l’OMS

La classification de l’OMS propose de classer les adénocarcinomes selon deux paramètres :  Le type histologique : en fonction des données cytologiques et architecturales quatre sous types peuvent être isolés :

 Adénocarcinome papillaire (tumeur exophytique, bien différencié).

 Adénocarcinome tubuleux (bien, modérément ou peu différencié)

 Adénocarcinome mucineux (colloïde muqueux) (>50% de composante mucineuse).

 Adénocarcinome à cellules indépendantes (>50% de cellules indépendantes).

 Carcinome adénosquameux.

 Carcinome épidermoïde.

 Carcinome à petites cellules.

 Carcinome indifférencié.

 Le degré de différenciation : Jean (2014).

 bien

 moyennement

Synthèse bibliographique Chapitre I : Généralités

9 VI.2. Classification pTNM des adénocarcinomes de l’estomac

 pTis : carcinome in situ

 pT1 : Tumeur infiltrant le chorion de la muqueuse ou la couche sous-muqueuse.

 pT2 : Tumeur infiltrant la couche musculeuse ou la sous-séreuse.

 pT3 : Tumeur infiltrant la séreuse.

 pT4 : Tumeur infiltrant les structures adjacentes.

 pN0 : Absence de métastase ganglionnaire.

 pN1 : 1 à 6 ganglions lymphatiques régionaux métastatiques.

 pN2 :7 à 15 ganglions lymphatiques régionaux métastatiques.

 pN3 : >15 ganglions lymphatiques métastatiques.

 pM0 : Absence de métastase à distance.

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

10

Les marqueurs tumoraux sont des composés qui reflètent la présence ou la progression d’une tumeur, il peut s’agir d’enzymes d’autres protéines ou peptides de faible poids moléculaire sécrétés par les tumeurs dans différents milieux biologiques, comme il peut s’agir aussi d’antigènes exprimés à la surface de la cellule cancéreuse (l'antigène carbohydrate 19-9). Ces derniers, peuvent être libérés et détectés dans la circulation, ce qui ferait d’eux des témoins de la maladie cancéreuse (El alaoui, 2009).

Les marqueurs tumoraux, peuvent également aider au dépistage du patient asymptomatique, à l’établissement du diagnostic et du pronostic ainsi qu’au suivi thérapeutique de la maladie oncologique. C’est le cas avec HER2, facteur de mauvais pronostic du cancer du sein qui pourrait s’avérer devenir un élément de pronostic bénéfique si l’on considère qu’il ouvre la voie à une thérapeutique efficace. HER2 est un modèle pour l’étude des altérations d’autres oncogènes permettant de développer des outils tant diagnostique que thérapeutiques.

I. Human epidermal growth factor receptor2 (HER2) I.1.Définition

HER2 est le nom plus connu du gène ErbB2, signifie human epidermal growth factor

receptor 2, c’est-à-dire récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (Société

canadienne du cancer, 2017). Le récepteur HER2 fait partie d’une famille de quatre récepteurs transmembranaires à activité tyrosine kinase appelés erbB ou HER (HER1, HER2, HER3, HER4) (Larbouret et al., 2007), du facteur de croissance EGF qui est impliqué dans le développement et le fonctionnement normal de différents organes, c’est une tyrosine kinase membranaire, la surexpression de récepteur est retrouvée dans 10 à 30% des cancers du sein et 7 à 34% des cancers de l’estomac ( Soularue, 2014). Lorsqu’il est activé, il fournit à la cellule des puissants signaux prolifératifs et anti-apoptotiques .La surexpression ou amplification de récepteur est prouvé par des méthodes appropriées, HER2 est un cible thérapeutique précieuse, (Lahzaoui, 2013).

I.2. La structure du récepteur HER2

L’HER2 est un récepteur de 185 kDa, situé sur le chromosome 17q21 (Almhanna, 2013) (Figure 02).

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

11 Figure 02 : La localisation du récepteur HER2 sur le chromosome 17 détecté par la

technique l’immunofluorescence (Lahzaoui, 2013).

Le récepteur HER2 est composé d’une région extracellulaire liant le ligand, une région transmembranaire et une troisième intra-cytoplasmique possédant une activité tyrosine kinase (Figure 03).

 Le domaine extracellulaire elle est composé de 4 sous domaines (de I à IV) répétés deux a deux et se succédant en alternance.

 Le domaine transmembranaire composé d’une courte séquence d’acides aminés (23, 24 AA) caractérisés par leur très grande hydrophobie.

 Le domaine Inta-cytoplasmique composé d’une région juxta membranaire dont le rôle n’est pas entièrement élucidé, un domaine à activité tyrosine kinase et un domaine C terminal riche en site de phosphorylation très important pour la conduction du signal. La région extracellulaire de l’ErbB2 est différente des autres.. En outre, cette structure rend la liaison au ligand impossible parce que l'emplacement n’est pas accessible pour l'interaction.

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

12 Figure 03 : Structure schématique des récepteurs de la famille ErbB (Lahzaoui, 2013).

I.3.Mécanisme d’activation

En l’absence de ligand, ces récepteurs existent majoritairement sous forme de monomères inactifs (Lahzaoui ,2013) .La fixation d’un ligand sur la partie extracellulaire de son récepteur va induire un changement de conformation et une homodimérisation ou une hétérodimérisation avec un autre récepteur de la même famille (HER2, HER3, HER4) (Larbouret et al., 2007). Les résidus tyrosines intracellulaires s’autophosphorylent et deviennent des points d’ancrage pour des complexes protéiques qui vont, à leur tour, activer de nombreuses cascades de signalisation (Larbouret et al., 2007). Finalement, le complexe ligand/récepteur est internalisé et l’expression de gènes impliqués dans la croissance cellulaire, l’inhibition de l’apoptose, l’angiogénèse ou le processus métastatique est induite.

I.4.Oncogène cellulaire

Les récepteurs ErbB ont été les premiers récepteurs membranaires clairement impliqués dans la genèse de beaucoup de cancers, notamment les tumeurs solides, par différents mécanismes. Les altérations observées sont des mutations, des surexpressions avec ou sans amplification du gène ou une stimulation anormale par leur ligand. L’implication d’ErbB2 ou HER2 dans la cancérogénèse est le fait de sa surexpression souvent due à une amplification génique

Domaines I.1 CR 1 Extracellulaire I.2 CR2 Transmembranaire Juxtamembranaire Tyrosine Kinase C-terminal Milieu Extracellulaire Cytoplasme

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

13

(Figure04), telle que décrit dans le cancer du sein, estomac. Surexpression du récepteur HER2 due a une amplification génique (Lahzaoui, 2013).

Figure 04: surexpression du récepteur HER2 due à une amplification génique

(Lahzaoui ,2013)

I.5.HER2 et le cancer gastrique

La détection de la surexpression du marqueur HER-2 est désormais bien standardisée dans le cancer gastrique (Soularue, 2014).

I.6.Indication

L’identification de l’expression du marqueur HER2 est recommandée chez les patients atteints d’un cancer gastrique avancé métastatique histologiquement confirmé chez qui on considère une thérapie ciblée (Bernard, 2011).

I.8.Méthodes de détermination du statut HER2

Le statut HER2 peut être évalué par Immunohistochimie (IHC) et/ou par hybridation in situ (HIS) sur coupes fixées et incluses en paraffine (Monges, 2010) (figure 05). Ces deux techniques présentent une grande spécificité puisqu’elles permettent une visualisation directe du signal recherché au niveau des cellules carcinomateuses, (Nshizirungu, 2014).

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

14 Figure 05 : Algorithme des tests pour la détection du marqueur Her2 dans le cancer de

l’estomac (Têtu et al., 2011).

Une surexpression de HER2 est considérée comme significative dans le cancer de l’estomac si elle concerne:

 au moins 5 cellules tumorales cohésives sur biopsie (même si la taille du foyer est inférieure à 10%).

 au moins 10% des cellules tumorales sur pièce opératoire. Le marquage fort incomplet en « U » basolatéral est pris en compte, et le marquage cytoplasmique n’a pas de valeur, (Soularue, 2014). L’intensité de la fixation en IHC est côté de 1 à 3, et détaillée dans le Tableau I

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

15 Tableau I: Classification du marquage HER-2 en IHC dans le cancer de l’estomac (Monges,

2010).

Caractéristiques du marquage HER-2 en IHC Score/classification

- Pas de marquage

ou marquage membranaire rare dans moins de 10 % des cellules tumorales si résection / moins de 5 cellules cohésives si biopsie

0/négative

- Marquage membranaire faible dans plus de 10 % des cellules tumorales si résection / plus de 5 cellules cohésives si biopsie - Visible au fort grossissement (× 40)

1+/négative

- Marquage membranaire complet, basolatéral ou latéral faible à modéré dans plus de 10 % des cellules tumorales si résection / plus de 5 cellules cohésives si biopsie

- Visible au grossissement intermédiaire (× 10-20)

2+/équivoque

> nécessite contrôle par FISH

Marquage membranaire complet, basolatéral ou latéral modéré à intense dans plus de 10 % des cellules tumorales si résection / plus de 5 cellules cohésives si biopsie

- Visible au grossissement faible (× 2,5-5)

3+/positive

I.9.Les principales voies de signalisation

Chretien(2011),L’activation des récepteurs ErbB induit la phosphorylation de résidus tyrosine au niveau de la queue cytoplasmique, ce qui active une infinité de voies de signalisationdont beaucoup ne sont pas encore bien caractérisées. Les principales voies de signalisation induites par les récepteurs ErbB : la voie Ras/MAPK et la voie des phosphoinositide 3 kinase (PI3K), qui sont impliquées dans la signalisation cellulaire. L’inhibition de ces voies de signalisation conditionne directement l’activité de thérapie ciblée dirigé contre des récepteurs à tyrosine kinase comme le récepteur H

ER

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

16

 La voie Ras/MAPK :

La voie Ras/MAPK présente un rôle central dans la régulation de la croissance et de la survie cellulaire d’un large spectre de tumeurs humains. Cette voie, après activation des récepteurs impliqués l’activation de ras. A l’origine d’une cascades des activités de phosphorisation induit à la fin un signal ERK (extracellular signal regulated kinases) qui va transloquer dans le noyau où elle active des différents facteurs de transcription de gènes impliqués dans la réplication et dans le cycle cellulaire. De nombreuses molécules ont été conçues pour inhiber différentes étapes de cette voie, et sont actuellement en cours d’évaluation.

 La voie PI3K

PI3K est un hétérodimère à activité kinase constitué d’une sous-unité régulatrice p85 et d’une sous-unité catalytique p110.

Elle peut être activée directement par ErbB2 ou par l’intermédiaire de la protéine Ras. La voie PI3K est une voie de signalisation intracellulaire impliquée dans la régulation de la survie cellulaire, la croissance cellulaire, la prolifération cellulaire et l’angiogenèse, et qui constitue un centre d’intérêt important dans l’étude de l’oncogenèse, (Raymond et al, 2009). L’activation de cette voie dans la pathologie cancéreuse favorise le développement tumoral, stimule la prolifération cellulaire et réprime l’apoptose. Cette voie est également impliquée dans le phénomène de diffusion métastasique (CHRETIEN, 2011). Cette voie est le plus activées par le biais d’un récepteurs membranaire, lui même stimulé par divers facteur de croissances, entraine la transmission d’un signal à travers le cytoplasme jusqu’au noyau, s’exerce plusieurs modulations de l’activation de certains gènes impliqués dans le développement tumoral, (Brauer, 2007).

II. Traitement

Rougier et al. (2016)indique quele protocole de traitement est établi en fonction l’état général de patient et de l’étendue du cancer :

II-1 La chirurgie

Si le cancer peut être opéré et que l’état général permet d’envisager l’intervention, une chirurgie consistant à enlever tout ou partie de l’estomac est proposée. Cette intervention d’exérèse de l’estomac est le traitement de référence des cancers de l’estomac sans métastase à distance et est le principal traitement permettant d’offrir une chance de guérison, (Rougier et

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

17 II-2 La chimiothérapie

La chimiothérapie est un traitement utilisant des médicaments anticancéreux.

Les principaux médicaments de chimiothérapie classique utilisés dans le traitement de cancer de l’estomac sont :

http://www.e-cancer.fr/patients-et-proche/les-cancer-de-l-estomac/chimiotherapie.

Le cisplatine (forme injectable), le5-fluorouracile (5-FU, forme injectable),Lacapécitabine (5FU, forme orle),L’épirubicine (forme injectable) et Le docetaxel (forme injectable).

Ces médicaments ont pour but de détruire les cellules cancéreuses ou d’empêcher leur prolifération, la chimiothérapie peut être proposée dans trois situations en cas de cancer de l’estomac.

II-3 La radiothérapie

La radiothérapie est un traitement médical qui consiste à administrer des rayons (on appelle cela un rayonnement ionisant) sur une région donnée du corps. Il s’agit le plus souvent d’un faisceau de rayons X (photons) produits par une machine appelée accélérateur de particules. Ce rayonnement va entraîner des lésions de l’ADN au niveau des cellules tumorales visées et entraîner leur destruction. La chimio-radiothérapie est un traitement médical antitumoral qui consiste à associer une chimiothérapie à la radiothérapie précédemment décrite, les deux traitements étant administrés en même temps (chimiothérapie concomitante), qui permet souvent une meilleure efficacité que la radiothérapie seule car la chimiothérapie va rendre les cellules tumorales encore plus vulnérables aux rayons.

II-4 La thérapie ciblée

Les nouveaux médicaments contre le cancer s’attaquent aux cellules tumorales en agissantsur des caractéristiques spécifiques à celles-ci. Ils doivent idéalement bloquer les systèmes de multiplication cellulaire qui existent uniquement dans les cellules tumorales et qui n’existent pas ou peu dans les cellules normales. Ces nouveaux médicaments sont appelés « thérapies

ciblées ». L’Herceptine (trastuzumab) est un anticorps monocloonal, conçu pour cibler et

bloquer le domaine extracellulaire de HER2 (Curiglianoet al., 2009).L’utilisation de l’Herceptine a été autorisée récemment pour les cancers gastriques métastasiques en association avec une chimiothérapie. Dans cette situation, le trastuzumab prescrit chez les malades sur-exprimant le récepteur HER2, améliore la survie globale moyenne des malades traités par l’Herceptine (Jean, 2014).Son activité anti-tumorale repose sur les mécanismes suivants (Soularue, 2014).

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

18 II.4.1.L’inhibition de la tyrosine kinase et des voies de signalisation sous-jacente,

conduisant à un arrêt du cycle cellulaire et à une inhibition de l’angiogénèse, via : - l’inhibition du clivage du domaine extra-cellulairede HER-2.

- l’inhibition de la dimérisation HER2-HER3 ligand dépendant, et donc de la voie de signalisation HER-3 dépendante sous-jacente (PI3K), permettant ainsi d’inhiber les mécanismes de prolifération et de survie cellulaire.

II.4.2.La cytotoxicité directement induite par le recrutement de cellules immunes effectrices, également appelée ADCC (Antibodydependantcellmediatedcytotoxicity); cette

hypothèse est corrélée avec l’augmentation de l’infiltrat tumoral lymphocytaire retrouvé après traitement néoadjuvant par trastuzumab dans le cancer du sein.

II.4.3.La stimulation de la destruction de HER-2 par endocytose

Herceptine déclenche le système immunitaire qui supprime la protéine HER2 induisant aussi la destruction de la tumeur de cibler et de détruire la tumeur (Figure 06).

Figure 06: Mécanismes d’action du Herceptine (trastuzumab) (Soularue, 2014).

III. La surveillance

La surveillance est une obligation pendant et après le traitement de tout cancer. Pendant le traitement, des bilans réguliers (généralement tous les 2 à 3 mois) doivent être effectués afin

Synthèse bibliographique Chapitre II : Les marqueurs tumoraux

19

de s’assurer de la bonne efficacité et de la bonne tolérance du traitement. Ils permettent d’adapter les doses de la chimiothérapie si nécessaire et de modifier le traitement initial .Le bilan inclut généralement un dosage des marqueurs tumoraux comme l’ACE, le CA 19.9 et le CA 125 surtout s’ils étaient élevés initialement (Rougieret al., 2016).

III.1.Les marqueurs tumoraux sériques

III.1.1.Le marqueur tumoral ca19-9

Le CA19-9 est le marqueur le plus utile dans le cancer gastrique avec une sensibilité de 60% à 65%, mais il n’est pas spécifique dans ce type de tumeur, (Noel, 2010).

III.1.1.1. La nature

L'antigène carbohydrate 19-9 (CA 19-9) ou GIGA (gastro-intestinal carbohydrateantigen) fait partie des antigènes tumoraux.C’est une glycoprotéine circulante de haut poids moléculaire (200 à 800 kDa). Il portant de manière répétitive un épitopecarbohydraté, penta saccharide sialylé, reconnu spécifiquement par l'anticorps monoclonal anti-CA 19-9. Il est synthétisé par les cellules du pancréas humain normal et des canaux biliaires, mais également par l'épithélium gastrique, colique, endométrial et salivaire (ELSACA19-9,2011).le CA19-9 joue un rôle dans l’adhésion cellulaire, sa valeur normale est < à 37UI/l, sa demi vie et de 3 jour, (Cainap, 2015).

III.1.1.2. Le rôle pathologique

Le CA19-9 constitue un ligand de l’E-séléctine, molécule endothéliale d’adhésion leucocytaire. Il favorise l’adhésion des cellules malignes à l’endothélium vasculaire, ainsi la dissémination hématogène des cellules exprime cet antigène. Il se trouve, en outre, inhibiteur de l’adhésion des leucocytes à l’endothélium péri-tumoral engendrant ainsi une immunodépression locale, (El alaoui, 2009).

III.1.1.3. Le dosage de marqueur CA 19-9

Le dosage de marqueur tumoral sérique ca19-9 est effectué pour déterminer la quantité du CA 19-9 dans le sérum et le plasma humain par une technique (Électrochimiluminescence) qui utilise des anticorps monoclonaux.

Partie expérimentale Matériels et méthodes

20

Notre étude a pour but la recherche de la surexpression d’HER2 dans le cancer gastrique. HER2 est un récepteur transmembranaire de type tyrosine kinase du facteur de croissance épidermique humain 2, la surexpression de ce récepteur joue un rôle important dans la prolifération, l’apoptose, l’adhérence, l'angiogenèse et l'agressivité de nombreuses tumeurs solides y compris le cancer gastrique.

I-Matériel et méthodes

I-1- Milieu et période d’étude

Notre travail a été réalisé au sein du laboratoire d’anatomopathologique et de biochimie du Centre Pierre et Marie Curie, à Alger durant la période allant de 10 janvier à 28 mai 2017.

I-2- Le principe de l’étude

Notre travail est une étude rétrospective qui a concerné 70 dossiers de 70 patients atteints d’un adénocarcinome gastrique (ADK), dont l’âge varie de 19 à 80 ans, colligés et hospitalisés au CPMC durant l’année 2016.

La présence de la maladie a été prouvée par différents examens : cliniques, biologiques, et anatomopathologiques (Histologie et IHC).

Notre travail est devisé en trois parties :

Figure 07 : Diagramme général de plan de travail.

I.3. Matériel et réactifs

I.3.1.Le matériel et réactifs utilisés pour réaliser une étude histologique se compose de :  L’histokinetteLeica TP1020: automate de fixation et d’imprégnation.

 Distributeur de paraffine Leica.

Etude rétrospective Etude anatomopathologique Dosage de marqueurtumoral

tumotumoral

Etape pré-analytique Etape analytique

70 dossiers des patients Le marqueur CA19-9

Partie expérimentale Matériels et méthodes

21  Microtome Leica RM2235.

 Bain marie.

 Automate de coloration Leica Auto Stainer XL.

 Congélateur.

 Etuve.

 Lames et lamelles.

 acier inoxydable.

Pour les produits et réactifs nous avons utilisé  Paraffine liquide.  Eau distillée.  Ethanol.  Xylène.  Hématoxyline.  Eosine.

I.3.2.Matériel et réactifs utilisés pour la réalisation de la technique d’immun-histochimie  Chambre humide.  Lames silanisées.  portoir.  Ac secondaire  Ac primaire

Les produits et réactifs sont

 Bac à alcool, xylène, et à eau distillée.

 solution de démasquage TRS Traget Retrieval Solution

 solution de blocage Dual Endogenous Enzyme lock

 PBS (Phosphate Buffered Saline)

 AC primaire et AC secondaire

 Concentré DAB (3-3 Diamino Benzidine) +Chromogène.

 Dakofaramountaqueousmounting.

Partie expérimentale Matériels et méthodes

22 I.3.4.Matériel et réactifs pour le dosage de marqueur tumoral sérique CA19-9

 L’automate Elecsys 1010/2010 et MODULAR ANALYTICS E170 (module Elecsys) de Roche.

 Microparticules tapissées de streptavidine, 1 flacon contenant 6,5 ml (bouchon transparent) :

 microparticules tapissées de streptavidine 0,72 mg/ml, capacité de liaison : 470 ng de biotine/mg de microparticules ; conservateur.

 R1 Anticorps anti-CA 19-9~biotine, 1 flacon contenant 10 ml (bouchon gris) : anticorps anti-CA 19-9 monoclonal (de souris) marqué à la biotine 3 mg/l ; tampon phosphate 100 mmol/l, pH 6,5; conservateur.

 R2 Anticorps anti-CA 19-9~Ru(bpy){, 1 flacon contenant 10 ml (bouchon noir) : anticorpsanti-CA 19-9 monoclonal (de souris) marqué au ruthénium 4 mg/l ; tampon phosphate 100 mmol/l, pH 6,5 ; conservateur (Roche® ,2010)

II. Méthodes

II.1. Etude rétrospective

Pour réaliser notre étude rétrospective, nous avons procédé à la consultation des dossiers des patients qui nous a permis l’obtention des informations suivantes :

 Le sexe

 L’âge

 La localisation de la tumeur au niveau de l’estomac

 Le type histologique

 Le grade histologique

 Le stade selon la classification d’OMS pTNM 2010.

II.2. Etude anatomopathologique

Le diagnostic de certitude d’adénocarcinome gastrique repose sur l’examen histologique, montrant la présence de cellules tumorales, et permettant de préciser le type histologique par analyse microscopique. C’est l’examen anatomopathologique qui permet d’établir de façon

définitive le diagnostic de l’ADK. On parle de preuve histologique.

A l’issue de l’examen anatomopathologique, le pathologiste rédige un compte-rendu où il donne les résultats et précise les caractéristiques de l’ADK. Ce compte-rendu est transmis au médecin traitant. Pour cette partie anatomopathologique nous avons procédé ainsi :

Partie expérimentale Matériels et méthodes

23

Les prélèvements tissulaires des échantillons analysés au laboratoire sont obtenus, soit par biopsie, soit par résection d’une pièce opératoire ou des blocs communiqués.

 Etape pré -analytique

Après la réception des prélèvements, nous avons enregistré les informations suivantes : -le nom du patient

-le numéro anatomopathologique -le service

II.2.1.Étude macroscopique

L’analyse macroscopique effectuée par le pathologiste donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment la taille et la localisation du cancer). Au cours de l’examen macroscopique, le pathologiste sélectionne les territoires à prélever pour l’étude microscopique : zones lésées, zones d’aspect macroscopique sain et limites de l’exérèse. La macroscopie est un diagnostic à l’œil nu où le médecin prélève un échantillon suspect et le met directement dans une cassette préalablement identifiée avec le numéro du dossier du patient pour éviter toute erreur entre les patients (Figure 08). Cette étape se fait dans la salle de macroscopie où tous les prélèvements reçus se préparent sous l’hôte aspirante.

Figure 08: La mise en place des fragments dans une cassette et la numération II.2.2. Etude histologique

II.2.2.1. Préparation des échantillons pour l’étude microscopique

L’étude microscopique se fait sur des préparations tissulaires qui subissent des transformations ; elle est divisée en plusieurs étapes :

Etape 01: Fixation

La fixation est indispensable pour conserver la morphologie cellulaire. Elle doit être effectuée immédiatement après l’obtention du prélèvement. Son pour but est de s’opposer à l’autolyse prématurée des cellules responsable de la putréfaction des tissus, et garantir la

Partie expérimentale Matériels et méthodes

24

conservation des structures des prélèvements dans un état proche de l’état vivant. La durée de fixation indispensable, des pièces opératoires est de 24h minimum; pour les biopsies c’est 6h. Toute fixation défectueuse rend l’étude anatomopathologique difficile voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu). A cet effet,

 Le volume de fixateur doit représenter environ 10 fois le volume de la pièce.  Le fixateur utilisé : est une solution de formol à 10 % tamponné.

 La cassette est mise dans 02 bains de la solution de formol (30 min pour chacun).

Etape 02: Circulation des tissus

Elle comporte 03 étapes essentielles :  Déshydratation

L’échantillon est progressivement déshydraté par passages successifs dans des solutions alcooliques de plus en plus concentrées : 05 bains de degrés croissants : (75%, 80%, 90%, 95%, et 100% pendant 02h pour chaque bac d’alcool) jusqu’à ce que toute l’eau (des tissus et du milieu de fixation) ait été soustraite et que l’échantillon soit totalement imprégné d’alcool absolu. (Figure 09).

 Eclaircissement

L’alcool est ensuite remplacé par un solvant organique de la paraffine dans lequel peuvent se dissoudre à la fois l’alcool et la paraffine (la paraffine n’est pas soluble dans l’eau). Donc l’alcool est chassé par 03 bains successives de xylène (02h, chacun). Ce dernier va rendre le tissu transparent(Figure 09) .

 Imprégnation

Nous avons imprégné l’échantillon ou l’enrobé dans la paraffine liquide (02 passages pendant 02h puis 03h successivement) ce qui va durcir le prélèvement cela nous a permis d’obtenir une pièce qui ne contient ni eau, ni alcool, ni solvant intermédiaire(Figure 09) .

Partie expérimentale Matériels et méthodes

25 Figure 09: Automate Histokinette permettant l’inclusion des échantillons fixés dans de la

paraffine après déshydratation.

Etape 03: Inclusion en paraffine chauffée

L’échantillon est ensuite immergé dans de la paraffine chauffée à une température dépassant juste son point de fusion, puisque celle-ci est solide à température ambiante.

Cette étape ne peut être réalisée que si la pièce est complètement déshydratée et elle est réalisée grâce à un automate d’inclusion qui se charge de la mise à disposition d’un bloc de paraffine prêt à être couper.

La pièce est mise dans un moule en acier inoxydable déposé sous un robinet qui sert à verser de la paraffine chaude (70°C). Puis le moule est mis dans une chambre froide (-0°C) pour que la paraffine se solidifie rapidement et la pièce sera incluse parfaitement là-dedans (Figure 10 (a)).

Il faut bien appuyer sur la pièce pour la fixer dans le fond du moule et pour qu’elle soit couverte complètement par la paraffine (Figure 10 (b)).

Pour identifier le bloc, nous avons remet la cassette sur le moule, avant que la paraffine ne soit complètement refroidie (Figure 10 (c)).

Partie expérimentale Matériels et méthodes

26 Figure 10: Inclusion de la pièce dans les moules dans la paraffine chaude. (a) : La pièce est

mise dans un moule en acier inoxydable, (b) : la pièce est dans la paraffine chaude, (c) : la remise de cassette sur le moule.

 Refroidissement

Une fois l’échantillon bien imprégné, nous l’avons laissé refroidir dans un congélateur pour quelques minutes (-60°C), cela permet de renforcer leur solidité et faciliter leur coupe (Figure 11).

Figure 11: Refroidissement des pièces et obtention des blocs solides de paraffine.

Etape 04 : Réalisation de coupes

Après refroidissement, le fragment, imbibé de paraffine, se trouve inclus dans un bloc solide à partir duquel, grâce à un microtome comportant un rasoir, nous avons réalisé des coupes de 05 microns d’épaisseur qui sortent en formant un ruban ( Figure 12) .

c

b

Partie expérimentale Matériels et méthodes

27 Figure 12: Obtention des coupes sous forme d’un ruban.

Les coupes sont par la suite recueilliées sur lames de verre après les avoir mis dans un bain marie qui va faciliter leur étalement sur les lames (Figure 13). Ces dernières sont numérotées et mises dans l’étuve (1h30/ 48-57°C) pour augmenter l’adhésion des rubans tissulaires sur la lame et les déparaffiner.

Figure 13: Etalement des coupes sur la lame.

Etape 05 : La coloration des coupes par Hématoxyline-Eosine (HE)

Les tissus de l'organisme ne sont pas spontanément colorés, ce qui rend les observations difficiles. Les colorants utilisés en histologie sont plus ou moins sélectifs ; la plupart sont des composants acides ou basiques en milieu aqueux qui forment des sels avec les radicaux

Partie expérimentale Matériels et méthodes

28

ionisés des tissus. Des composants acides sont utilisés pour les zones tissulaires basophiles et des composants basiques sont utilisés pour les zones tissulaires acidophiles.

Dans notre cas, la coloration est réalisée par l’hématoxyline Eosine (HE) où L'hématoxyline est une substance basique, qui colore les noyaux en violet. L'éosine est une substance acide, qui colore les cytoplasmes en rose. Cette coloration nécessite :

 Réhydratation

Pour que l'on puisse utiliser une coloration, la paraffine doit être éliminée. On procède donc au déparaffinage, qui consiste à passer les lames dans des bains de xylène afin de dissoudre la paraffine. On effectue ensuite une réhydratation : l'alcool se mélange avec l'eau et le xylène, on passe les lames dans des bains d'alcool de degré décroissant (de 100°, 95°, 90°, 80°, 75°C). Les étapes de réhydratation et coloration ont été réalisés par un automate de coloration (Figure 14), les étapes sont les suivantes :

 Nous avons mis les lames dans un bain de xylène pur pendant 18 min, pour éliminer la paraffine

 puis dans l’éthanol à degré décroissant (18 min) pour la réhydratation

 puis nous avons procédé à un lavage avec de l’eau distillée

 ensuite dans l’hématoxyline (06 min) pour colorer le noyau

 puis nous avons effectué un lavage avec l’eau distillée

 puis dans l’éosine (02 min) pour colorer le cytoplasme

 un lavage avec l’eau distillée a été réalisé

 et enfin dans l’éthanol pendant 06min, pour terminer dans le xylène (15 min) pour l’éclaircissement.

Partie expérimentale Matériels et méthodes

29

 Montage

Après séchage des lames, les étalements tissulaires sont montés entre lame et lamelle avec résine synthétique dont l’indice de réfraction est voisin de celui du verre.

Ces lames sont numérotées et prêtes à être observer à l’aide du microscope optique (Figure 15).

Figure 15: étapes de montage des lames. II.2.2.2.Etude microscopique

Après le montage, les lames ont était lues et interprétées en présence du médecin anatomopathologiste sous microscope photonique qui permet l’enregistrement de l’image observée. Au début on utilise un faible grossissement pour la capture d’une bonne image de la tumeur, puis on passe au fort grossissement pour mieux analyser les détails de la tumeur (cellulaire et nucléaire). Une bonne lecture des lames est indispensable pour un diagnostic précis du stade et de grade de la tumeur (Figure 16).

Partie expérimentale Matériels et méthodes

30 Figure 16: Visualisation des lames sous microscope optique (Grossicément 40)

 Etape analytique

II.2.3. Immunohistochimie (IHC)

L’IHC consiste à mettre en évidence certaines protéines cellulaires, qu'elles soient cytoplasmiques, membranaires ou nucléaires, spécifiques pour un type ou une fonction cellulaire, à l'aide d'une réaction antigène – anticorps. Le complexe formé étant rendu visible, donc localisable, par un marqueur fluorescent ou enzymatique fixé directement ou indirectement sur l’anticorps. L’IHC est réalisée en premier lieu, seul les cas douteux (IHC2+) sont vérifiés par HIS. Dans notre travail, la recherche du profil HER2 est faite seulement par IHC et elle était suffisante dans 100% (30 cas).

Cette technique se réalise à la demande de l’anatomopathologiste. Son but est d’aider au diagnostic dans les cas difficiles et de déterminer la thérapeutique adéquate.

II.2.3.1.Les différentes étapes de la technique d’immunohistochimie

III.2.3.1.1.Réalisation des coupes

Nous avons donc réalisé des nouvelles coupes à partir des blocs de paraffine sélectionnés par le pathologiste. Le microtome est ainsi réglé pour obtenir des échantillons d’une épaisseur de 4 à 5 μm, les coupes obtenues ont été étalées dans un bain marie puis recueillies sur des lames spéciales (les lames silanisées) pour une meilleure adhésion et éviter le découlement

Partie expérimentale Matériels et méthodes

31

des étalements lors de la manipulation. Les lames sont par la suite mises dans l’étuve à 37°C pendant 24h pour leur séchage.

II.2.3.1.2.Déparaffinage et réhydratation (Figure 17)

- Les lames sont mises dans le xylène pur (15 min) pour éliminer l’excès de la paraffine. - Les lames sont mises ensuite dans l’alcool pur (15 min) la réhydratation.

- Puis, elles sont mises dans l’eau distillée (10 min) pour le rinçage .

Figure 17: Les lames sont mises dans les 03 becs de : xylène, alcool et eau distillée

successivement.

II.2.3.1.3. Démasquage nous l’avons réalisé comme suit :

 mettre la solution de démasquage TRS (traget retrieval solution) à pH 6 déjà préparée (elle va être diluée à 1/10 dans l’eau distillée) dans le bain marie à 93°C ;

 mettre les lames dans la solution de démasquage et les porter au bain chaud (dit à la cocotte-minute) pendant 40 minutes ; (cette solution permet de révéler les antigènes masqués par des molécules antagonistes) (Figure 18) .

 sortir les lames du bain marie et laisser refroidir sur la paillasse dans la solution de démasquage pendant 20 minutes.

Partie expérimentale Matériels et méthodes

32 Figure 18: mettre les lames dans la solution de démasquage

 Après séchage des lames, nous avons (avec l’aide de médecin) dessiné sur la lame, un cercle autour de la zone fixée avec le crayon hydrophobe (DakoPen) pour faciliter le dépôt de l’AC primaire en limitant la zone de diffusion des solutions d’immunohistochimie sur le prélèvement et éviter toute déperdition et contamination des colorations (Figure 19).

Figure 19: Traçage avec le Dako Pen.

II.2.3.1.4.Blocage de peroxydase endogène

 Pour réduire la coloration de fond indésirable dans l'IHC causée par l'activité de la peroxydase endogène, la solution de blocage ( Dual Endogenous Enzyme Block ) est appliquée sur la coupe tissulaire.

Partie expérimentale Matériels et méthodes

33

 L’ajout de la solution de blocage Dual Endogenous Enzyme lock (peroxydase+ eau oxygénée (H2O2)) sur la zone limitée par le Dako Pen (10-15min) où le peroxyde d'hydrogène (H2O2) contenu dans la solution inactive ou empêche l'activité de la peroxydase endogène (Figure 20).

 Rinçage des lames avec l’eau distillée puis P S (Phosphate uffered Saline) pendant 5 minutes (Figure 20).

Figure 20 : L’ajout de la solution de blocage Dual Endogenous Enzyme lock et le rinçage

avec le PBS.

II.2.3.1.5.Marquage à l’anticorps primaire

 Le marquage est réalisé en déposant quelques gouttes de l’anticorps primaire anti-HER2 (Figure 21), et le laisser par la suite incuber pendant 30 minutes. A la fin nous avons effectué un rinçage dans deux bains de solution PBS (2x5 min).

Partie expérimentale Matériels et méthodes

34 II.2.3.1.6.Traitement par l’anticorps secondaire

Cette étape est effectuée comme suit :

- Dépôt de l’AC secondaire polymère marqué pour recouvrir l’échantillon (Figure 22). - Incubation pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.

- rinçage avec l’eau distillée puis le T S (2x5 min).

Figure 22: Dépôt de l’AC secondaire.

II.2.3.1.7.Application de chromogène

Pour recouvrir l’échantillon (L’activation enzymatique du chromogène génère un produit de réaction visible au niveau du site antigénique, coloration ou positivité marron) nous avons appliqué suffisamment la solution de substrat chromogène de la peroxydase DAB (3-3 Diamino Benzidin) (Figure 24). Ensuit incuber pendant 10 minutes puis Rinçage à l’eau distillée.