M ETIERS DU G ROUPE OCP

A medida de resistividade elétrica foi realizada nas peles que foram utilizadas como membrana nos experimentos de penetração para verificar se o EC das mesmas estava íntegro para uso nos experimentos (TANG et al., 2001). Para isso, as peles foram montadas em células de difusão vertical tipo “Franz” e seu compartimento doador e receptor preenchido com tampão fosfato 10 mM, pH 7,4. Para determinar a resistência conferida pelo EC a passagem de uma corrente elétrica, foi utilizado um gerador de sinal (modelo 33210A Agilent) e eletrodos de Ag/AgCl (In Vivo Metrics) inseridos no compartimento doador e receptor das células. O eletrodo em contato com o meio receptor foi ligado ao gerador de sinal e uma corrente alternada de 100 mV (RMS) de potência e 10 Hz de frequência foi aplicada. A corrente elétrica gerada foi então medida através de outro eletrodo inserido no compartimento doador ligado a um multímetro (Minipa ET 2053) (Figura 7), e a resistência da pele foi calculada utilizando-se a lei de Omh. A resistência real da pele foi calculada subtraindo-se a resistência do sistema (sem a pele) do valor de resistência total. O valor de resistividade foi então obtido multiplicando-se o valor de resistência real pela área da pele disponível para permeação (1,13 cm2). As peles adequadas para uso, consideradas intactas, apresentaram valor de resistividade >50 KΩ.cm2 (POLAT et al., 2010).

Figura 7. Ilustração da medida da resistividade elétrica da pele (R) (HUBER, 2013). 4.8.2. Recuperação da OVA da pele

Uma amostra de pele de aproximadamente 1 cm2 foi picotada, colocada em um tubo cônico de polipropileno estéril e adicionada de 50 µL de soluções de OVA em tampão fosfato 10 mM pH 7,4 nas concentrações de 2,5, 3 e 4 ng/mL. O tubo com a pele foi deixado aberto

por 1 h para a evaporação do tampão, adicionado de 5 mL do tampão fosfato e deixado em repouso durante a noite. Após esse período, a dispersão foi filtrada para remoção da pele e a OVA quantificada no filtrado por ELISA (kit da Alpha Diagnostic, Texas, USA, número de catálogo 6050).

A porcentagem de OVA quantificada em relação à quantidade total adicionada foi considerada como sendo a porcentagem de recuperação.

Como controle foi feita uma curva analítica nas concentrações de 0,125 a 2 µg/mL de OVA como descrito no item 4.9.1.

4.8.3. Preparo dos eletrodos usados na iontoforese

Os eletrodos utilizados foram eletrodos de prata (Ag) e cloreto de prata (AgCl) obtidos conforme descrito por Lopez (2000). Resumidamente, para a obtenção do eletrodo negativo (cátodo), um fio de prata (99,9 % de pureza) com a ponta dobrada foi imerso em uma pequena quantidade de cloreto de prata fundido em cadinho, e então removido com a extremidade dobrada repleta de cloreto de prata solidificado. Para o preparo do eletrodo positivo (ânodo), foi montado um circuito elétrico em série contendo fios de platina e eletrodos de AgCl mergulhados dentro de uma solução salina de NaCl (5,78 M). Uma corrente de 0,4 mA foi passada pelos eletrodos por 8 h, saindo do terminal positivo ligado a platina e se ligando ao terminal negativo nos eletrodos de AgCl para que este fosse reduzido à Ag.

4.8.4. Iontoforese in vitro

Foram utilizadas células de difusão verticais tipo “Franz”, as quais apresentam o compartimento doador e o compartimento receptor. Os eletrodos utilizados nos experimentos de iontoforese in vitro da OVA foram os eletrodos de Ag e AgCl (item 4.8.3) (LOPEZ et al., 2001, GREEN, 1991).

A célula de difusão foi montada com a pele separando os compartimentos doadores do compartimento receptor. Este último foi preenchido com uma solução de tampão fosfato 10 mM pH 7,4 contendo 137 mM de NaCl. Na porção superior da célula foram adicionados 2 mL das formulações estudadas: dispersão de OVA em tampão fosfato (OVA-PBS), dispersão de lipossomas aniônicos, compostos por PC e DOPE na proporção de 3:1, respectivamente, contendo OVA a 5,0 mg/mL (OVA-lipossoma(-)), dispersão de lipossomas aniônicos contendo OVA a 5,0 mg/mL e NPAg (OVA-lipossoma(-) com NPAg), dispersão de lipossomas catiônicos, compostos por DMPC e DOTAP, na proporção de 1:1, contendo OVA

a 0,25 mg/mL (OVA-lipossoma(+)) e dispersão de lipossomas catiônicos contendo OVA a 0,25 mg/mL e NPAg (OVA-lipossoma(+) com NPAg). Todas as formulações, tanto aniônicas como catiônicas foram submetidas à iontoforese anódica e apenas as formulações aniônicas foram submetidas à iontoforese catódica. Para a realização da iontoforese anódica, o eletrodo de Ag foi colocado em contato com a formulação, no compartimento doador, e no compartimento receptor foi colocado o eletrodo de AgCl. Já para a realização da iontoforese catódica, o eletrodo de AgCl foi colocado em contato com a formulação, no compartimento doador, e no compartimento receptor foi colocado o eletrodo de Ag. Estes eletrodos foram ligados a uma fonte de energia (Futron Data Controles Ltda, ACC200.2.20) e submetidos a uma corrente elétrica constante de 0,5 mA/cm2 por 15 min. A variação de potencial (voltagem) necessária para manter a corrente constante em resposta à resistência da pele de porco foi monitorada com o auxílio de um multímetro. A solução receptora foi mantida a 37ºC. As mesmas formulações também foram colocadas em contato com a pele pelo mesmo período de tempo (15 min) na ausência da iontoforese para se analisar a penetração passiva da OVA.

4.8.4.1. Determinação da OVA retida na pele

No final do experimento de iontoforese in vitro, a pele foi removida da célula de difusão e presa em uma superfície lisa com o EC voltado para cima. A parte da pele submetida à difusão foi então retirada através da técnica do “tape stripping” (item 4.8.4.2.). A pele sem EC (epiderme viável e derme), a partir de agora denominada “epiderme viável”, foi picotada, adicionada em um tubo cônico de polipropileno estéril, juntamente com tampão fosfato 10 mM pH 7,4 como solvente extrator da OVA e deixado durante a noite para a extração da proteína. Após esse período foram realizadas diluições seriadas com o objetivo de chegar a concentrações adequadas de OVA para sua quantificação por ELISA (item 4.9).

4.8.4.2. “Tape stripping”

O EC foi separado da “epiderme viável” utilizando-se 15 fitas adesivas. A remoção mais ou menos completa do EC após este procedimento foi indicada pelo "brilho" da face exposta da pele (epiderme viável). As 15 fitas adesivas contendo partes do EC foram colocadas conjuntamente em um tubo, e a OVA nelas contida foi extraída com 10 mL de tampão fosfato 10 mM pH 7,4 durante uma noite, seguido da quantificação da OVA por ELISA (item 4.9).