R ´ ESULTATS COMPL ´ EMENTAIRES

I Pr´eambule

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est caract´eris´ee par une expansion anormale de triplets CTG dans l’extr´emit´e 3’UTR du g`ene DMPK, entraˆınant la s´equestration des transcrits mutants dans des foci nucl´eaires. Ceux-ci entraˆınent la s´equestration du facteur d’´epissage MBNL1 induisant de multiples d´efauts d’´epissage.

R´ecemment une ´etude a montr´e que MBNL1 et DDX5 interagissent `a la fois dans des myoblastes humains contrˆoles et DM1 (Paul et al., 2011). D’autre part, une autre ´etude r´ecente a montr´e que DDX5 colocalise avec des r´ep´etitions CUG dans un mod`ele cellulaire mimant la DM1 (Laurent et al., 2012). DDX5 favorise le recrutement de MBNL1 au niveau des r´ep´etitions pathologiques ainsi qu’au niveau d’une structure en tige-boucle de l’ARN pr´e-messager Tnnt2 dont l’´epissage est alt´er´e dans la DM1. Des mutations au niveau du core h´elicase de DDX5 inhibent `a la fois le recrutement de MBNL1 et la colocalisation de DDX5 au niveau des r´ep´etitions CUG (Laurent et al.,2012).

Les auteurs proposent alors un mod`ele dans lequel la fonction de DDX5 serait de remodeler les structures secondaires de l’ARN afin de faciliter le recrutement de MBNL1 au niveau de ces s´equences r´egulatrices. Ainsi dans un contexte sain, en coordination avec DDX5, MBNL1 pourrait assurer sa fonction de facteur d’´epissage. Dans un contexte pathologique de gain de fonction de l’ARN comme la DM1, DDX5 permettrait le recrutement de MBNL1 au niveau des r´ep´etitions CUG entraˆınant sa s´equestration et sa perte de fonction (Laurent, 2011, Figure 34).

II. PROBL ´EMATIQUES 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

Figure 34: Mod`ele propos´e du rˆole de DDX5 dans la DM1. Dans les cellules saines, DDX5 forme un complexe avec MBNL1, ouvre localement la structure secondaire de l’ARN afin de faciliter son interaction avec ses sites r´egulateurs entrainant un ´epissage alternatif correct et la formation d’isoformes fonctionnelles. Dans un contexte DM1, le complexe DDX5/MBNL1 facilite la fixation de MBNL1 sur les paires de nucl´eotides G-C par l’ouverture locale des expansions CUG entraˆınant sa s´equestration dans la pathologie. L’absence de complexe DDX5/MBNL1 au niveau des cibles d’´epissage aboutit `a une alt´eration de l’´epissage alternatif de nombreux transcrits avec une expression d’isoformes aberrantes `a l’origine des symptˆomes cliniques (Adapt´e de Laurent, 2011).

II Probl´ematiques

DDX5 et DDX17, de par leurs nombreuses fonctions mol´eculaires, sont capables de r´eguler l’expression ainsi que l’´epissage de nombreux g`enes. Il est donc n´ecessaire dans un premier temps de d´eterminer l’impact de DDX5/DDX17 sur la fonction

et/ou l’expression de MBNL1. Ces deux prot´eines r´egulent-elles l’expression globale de MBNL1 ? MBNL1 est sujet `a l’´epissage alternatif, les diff´erentes isoformes qui en r´esultent ne pr´esentent pas les mˆemes fonctions (Kino et al., 2004). DDX5/DDX17 r´egulent-elles ces ´epissages ? Si oui, quel est l’impact fonctionnel pour MBNL1 ? C’est pourquoi d´eterminer pr´ecis´ement, dans un premier temps, l’impact de DDX5/DDX17 sur l’expression de MBNL1 apparaˆıt particuli`erement important dans un contexte biologique tel que la diff´erenciation o`u les profils d’expression de DDX5 et DDX17 changent.

D’autre part, si l’interaction prot´eique entre DDX5 et MBNL1 a d´ej`a ´et´e montr´ee, elle apparaˆıt jusqu’`a maintenant peu robuste (Paul et al.,2011;Laurent et al.,2012). Enfin, DDX5 et DDX17 ont ´et´e montr´ees n´ecessaires `a la diff´erenciation myog´enique en tant que prot´eines co-activatrices de MyoD (Caretti et al.,2006et notre manuscrit actuellement en r´evision dans Molecular Cell). D’autre part, nous montrons que, en coop´erant avec le facteur d’´epissage hnRNP H/F, DDX5 et DDX17 participent `a la mise en place d’un programme d’´epissage dans les cellules myoblastiques. Des d´efauts de diff´erenciation sont observ´es dans la DM1 (Timchenko et al., 2001b; Timchenko et al., 2004). Dans ce contexte, nous avons cherch´e `a d´eterminer quels ´etaient les ´ev´enements d’´epissage r´egul´es au cours de la diff´erenciation et qui sont d´ependants de DDX5/DDX17.

III DDX5/DDX17 et Mbnl1

A R´egulation de l’expression de MBNL1 par

DDX5/DDX17

Des exp´eriences de d´epl´etion de DDX5 et DDX17 montrent que ces deux prot´eines affectent l’expression globale de MBNL1 (Figure 35A). On observe une l´eg`ere diminution des deux isoformes principales exprim´ees dans les C2C12 avec un ratio final au profit de la forme longue. N´eanmoins il faut pr´eciser que ce r´esultat n’est pas toujours reproductible et varie d’une transfection `a l’autre.

III. DDX5/DDX17 ET MBNL1 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

Figure 35: DDX5/DDX17 r´egulent l’expression globale de MBNL1 ainsi que son ´epissage alternatif. (A) La d´epl´etion de DDX5/DDX17 impacte l’expression prot´eique globale de MBNL1 (Western Blot). (B) La d´epl´etion de DDX5/DDX17 impacte l’´epissage alternatif des exons 3 et 9 de MBNL1 (RT-PCR).

D’autre part, MBNL1 est un g`ene sujet `a l’´epissage alternatif. En particulier, chez la souris, trois exons peuvent ˆetre alternativement ´episs´es et impacter la fonction de ce facteur d’´epissage : ce sont les exons 3, 7 et 9 chez la souris (Figure 35B).

Le domaine de liaison `a l’ARN de MBNL1 est constitu´e de 4 motifs `a doigts de zinc (Znf) de type CCCH qui sont cod´es par les exons 1, 2 et 4. La r´egion cod´ee par l’exon 3 est localis´ee entre les motifs Znf2 et Znf3 et joue un rˆole d’espaceur (ou ≪linker≫). Sa pr´esence favorise l’affinit´e de liaison de MBNL1 aux ARN et est n´ecessaire `a la fonction de facteur d’´epissage de MBNL1 (Tran et al.,2011). L’exon 7 code pour un signal de localisation nucl´eaire et l’exon 9 semble ˆetre impliqu´e dans l’oligom´erisation de MBNL1 (Tran et al., 2011). On observe des variations de l’inclusion de deux de ces exons lorsque l’on d´epl`ete les h´elicases DDX5 et DDX17 (Figure 35B).

Ainsi l’exon 3 de MBNL1 apparaˆıt moins inclus en absence de DDX5/DDX17, sugg´erant une baisse d’affinit´e de MBNL1 pour les motifs CUG et donc de son activit´e de facteur d’´epissage en l’absence de DDX5/DDX17. Si l’exon 7 impliqu´e dans la localisation nucl´eaire de MBNL1 n’est pas alt´er´e, l’exon 9 est fortement inclus en l’absence de DDX5 et DDX17. Ces r´esultats sugg`erent qu’en l’absence de

DDX5 et DDX17, l’isoforme produite de MBNL1 a une moins bonne affinit´e pour ces ARNs cibles mais une meilleure capacit´e d’oligom´erisation.

Le profil d’´epissage de MBNL1 est ´egalement d´er´egul´e dans la DM1 (Dhaenens et al., 2008). En effet, on observe une surexpression de l’isoforme fœtale, incluant tous les exons alternatifs. Cette isoforme pr´esente une meilleure affinit´e de liaison `a ses motifs ARN, est localis´ee exclusivement dans le noyau et se dim´erise plus facilement que les autres isoformes de MBNL1. Ainsi les d´efauts d’´epissage de MBNL1 observ´es dans la DM1 pourraient contribuer `a favoriser sa s´equestration dans les foci nucl´eaires (Tran et al.,2011).

La d´epl´etion de DDX5 et DDX17 reproduit en partie le profil d’expression pathologique de MBNL1 observ´ee dans la DM1. On peut donc ´emettre l’hypoth`ese que la colocalisation de DDX5/DDX17 avec les foci DM1 pourrait avoir un impact `a la fois sur les alt´erations d’expression et de fonction observ´ees de MBNL1 dans la pathologie.

B Localisation de MBNL1

L’exon portant le signal de localisation nucl´eaire de MBNL1 n’est pas alt´er´e par un siARN ciblant DDX5 et DDX17. La localisation de ce facteur d’´epissage ne devrait donc pas ˆetre affect´ee. Nous avons confirm´e ce r´esultat pat ImmunoFluorescence anti-MBNL1 dans les cellules C2C12 en pr´esence et en absence de DDX5 et DDX17 (Figure 36).

III. DDX5/DDX17 ET MBNL1 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

Figure 36: La d´epl´etion de DDX5/DDX17 n’impacte pas la localisation de MBNL1.Immunofluorescence MBNL1 en condition de d´epl´etion de DDX5 et DDX17.

Tout comme dans les cellules contrˆoles, MBNL1 est observ´ee `a la fois dans le cytoplasme et dans le noyau lorsque l’on d´epl´ete DDX5 et DDX17.

Il est `a noter que l’on n’observe pas ou tr`es peu de diff´erence d’expression de MBNL1 dans ces conditions. Ce r´esultat peut en partie ˆetre expliqu´e par le fait que la diminution d’expression observ´ee par western blot est faible et qu’elle traduit l’expression moyenne de la prot´eine au sein d’une population cellulaire, `a la diff´erence de l’immunofluorescence.

C Interaction DDX5 entre MBNL1

L’interaction entre DDX5 et MBNL1 a ´et´e observ´ee dans le cadre de deux pr´ec´edentes ´etudes (Paul et al., 2011; Laurent et al., 2012). N´eanmoins cette interaction apparaˆıt ˆetre faible et variable en fonction de la technique utilis´ee. Cette faiblesse d’interaction peut, en partie, ˆetre expliqu´ee par la qualit´e des anticorps anti-MBNL1. En effet, les anticorps disponibles sont peu r´eactifs et mal adapt´es `a des techniques comme la co-immunopr´ecipitation qui n´ecessite de grande quantit´es de cellules et d’anticorps.

particuli`erement adapt´ee `a notre probl´ematique. Cette technique permet de d´etecter une proximit´e entre mol´ecules, et donc par≪ estimation ≫, une interaction directe. Ainsi peu de mat´eriel cellulaire est n´ecessaire pour r´ev´eler mˆeme des interactions faibles. On estime que le PLA g´en`ere un signal positif lorsque deux prot´eines se situent `a moins de 40nm l’une de l’autre.

L’interaction entre DDX5 et MBNL1 a ainsi ´et´e confirm´ee par PLA : on obtient l’essentiel des signaux positifs dans le noyau mais on observe aussi quelques spots dans le cytoplasme. En revanche, on ne d´etecte plus de signal lorsque l’on traite les cellules avec un siARN ciblant DDX5 et DDX17 (Figure 37).

Figure 37: Interaction de DDX5 et MBNL1 r´ev´el´e par Proximity Ligation Assay (In situ PLA).

Ces r´esultats montrent que DDX5 et MBNL1 interagissent `a la fois dans le noyau et le cytoplasme de cellules myoblastiques.

D Expression de MBNL1 durant la diff´erenciation

myog´enique

L’expression de DDX5 diminue au cours de la diff´erenciation myog´enique. Nous proposons que cette baisse d’expression contribue `a la reprogrammation du