d’´ epissage observ´ es dans la DM1 ?

A D´emarche

Notre deuxi`eme objectif ´etait de d´eterminer quels sont les ´ev´enements d’´epissage r´egul´es au cours de la diff´erenciation qui sont d´ependants de DDX5/DDX17. Parmi ceux-ci, nous voulions en particulier nous focaliser sur ceux qui sont importants

pour le ph´enotype musculaire et qui pourraient ˆetre d´er´egul´es de la mˆeme mani`ere chez les patients DM1, refl´etant potentiellement un lien avec l’activit´e de DDX5 et DDX17.

Pour ce faire, nous avons donc utilis´e de multiples jeux de donn´ees de puces≪tout exon≫, produits au sein de l’´equipe mais aussi publiquement disponibles. Dans la mesure o`u nous disposons de la lign´ee myoblastique murine C2C12, le jeu de donn´ees utilis´e pour g´en´erer les≪listes de r´ef´erence≫du projet a ´et´e obtenu au sein du laboratoire. Suite `a la transfection de cellules C2C12 avec un siARN contrˆole ou ciblant `a la fois DDX5 et DDX17, les cellules ont ´et´e trait´ees ou non pour entrer en diff´erenciation. On obtient alors des listes d’´ev´enements d’´epissage r´egul´es par la d´epl´etion de DDX5 et DDX17 dans des cellules en prolif´eration (non diff´erenci´ees), ainsi que des ´ev`enements d’´epissage r´egul´es au cours de la diff´erenciation et de fa¸con DDX5/DDX17-d´ependante.

Afin de se focaliser sur les ´ev´enements d’´epissage les plus susceptibles d’ˆetre impliqu´es dans le ph´enotype musculaire, nous avons ensuite uniquement s´electionn´e les ´ev´enements qui s’av`erent enrichi dans le tissu musculaire par rapports aux autres tissus. Pour cela, nous avons utilis´e des jeux de donn´ees publiques de puces comportant des dizaines de tissus dont le muscle, `a la fois chez la souris et l’homme. Le fait de travailler sur deux esp`eces diff´erentes a n´ecessit´e une ´etape d’annotation des exons conserv´es entre esp`eces. Celle-ci a ´et´e r´ealis´ee `a partir des g`enes orthologues tels que d´efinis par Ensembl puis les alignements entre exons ont ´et´e r´ealis´es `a l’aide du logiciel M´egablast. N’ont finalement ´et´e conserv´es que les exons orthologues uniques entre souris et homme et pr´esentant une identit´e de s´equence sup´erieure `a 80%.

Enfin, divers jeux de donn´ees de puces exon obtenus `a partir de patients DM1 ont ´et´e analys´es afin d’´etablir des listes `a large ´echelle d’´ev´enements d´er´egul´es dans la pathologie.

Nous avons donc cherch´e `a d´eterminer les ´ev´enements d’´epissage, dont la r´egulation au cours de la diff´erenciation est d´ependante de DDX5/DDX17, et qui pourraient refl´eter une alt´eration du processus de diff´erenciation des cellules musculaires chez les patients DM1. Le mod`ele propos´e dans notre publication pr´esente DDX5 et

IV. R ˆOLE DE DDX5/DDX17 DANS LES D ´EFAUTS D’ ´EPISSAGE OBSERV ´ES

DANS LA DM1 ? 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

DDX17 comme n´ecessaires, dans un premier temps, `a l’´epissage dans les cellules myoblastiques puis, dans un deuxi`eme temps, leur baisse d’expression contribuerait `a la mise en place du programme d’´epissage de cellules musculaires. C’est pourquoi nous avons d´efini deux groupes d’exons r´egul´es au cours de la diff´erenciation et d´ependants de DDX5/DDX17.

La validation de nos pr´edictions a ´et´e r´ealis´ee dans des ´echantillons C2C12 (+/-diff´erenciation, +/- DDX5/DDX17) ainsi que dans des ´echantillons de lign´ees DM1 immortalis´ees (+/- diff´erenciation) amicalement fournies par Denis Furling de l’Institut de Myologie `a Paris.

B 1`ere cat´egorie d’exons

Nous avons valid´e une s´erie d’´ev´enements d’´epissage r´egul´es au cours de la diff´erenciation et inversement r´egul´es en l’absence de DDX5/DDX17 et dans des ´echantillons DM1 (Tableau 6,Figure 39).

Ont ´et´e s´electionn´es les ´ev´enements r´egul´es durant la diff´erenciation dans au moins l’un des deux mod`eles (myoblastes C2C12 et myoblastes humains) mais d´er´egul´es `a la fois par la d´epl´etion de DDX5/DDX17 et dans la DM1.

Prot´eine Description Fonction

ABLIM1 Actin Binding LIM Protein 1 Prot´eine cytosquelettique LIM, joue un rˆole majeur dans la r´egulation des voies de voies de d´eveloppement cellulaire. Joue potentiellement un rˆole dans le d´eveloppement de la r´etine. BIN1 Bridging Integrator 1 Prot´eine impliqu´ee dans les invaginations tubulaires des

membranes, est requise pour la biog´en`ese des tubules musculaires T.

FEZ2 Fasciculation And Elongation Protein Zeta 2

Prot´eine n´ecessaire `a l’empaquetage et l’´elongation des faisceaux d’axones.

ITGB1 Int´egrine, Beta 1 Prot´eine participant `a l’innervation et la vascularisation du muscle squelettique.

MSI2 Musashi RNA-Binding Protein 2

Prot´eine qui se lie `a l’ARN r´egulant l’expression d’une s´erie d’ARNm cibles au niveau traductionnelle. Joue potentiellement un rˆole dans la prolif´eration et la maintenance des cellules souches dans le syst`eme nerveux central. MYOM1 Myom´esine Prot´eine musculaire se liant `a la myosine et la titine, constitue

l’un des composant majeur des fibres musculaires formant les bandes M, impliqu´ee dans l’´elasticit´e des bandes M.

NUMB Numb Homolog (Drosophila) Prot´eine r´egulatrice de la division asym´etrique, de l’adh´esion cellulaire et de la polarit´e. Joue un role dans la neurog´en`ese. PPP2R5C Prot´eine Phosphatase 2,

sous-unit´e B’, Gamma

Une des quatre Ser/Thr phosphatases majeures, impliqu´ee dans le contrˆole n´egatif de la croissance cellulaire et la division.

Table6: G`enes dont l’´epissage est r´egul´e au cours de la diff´erenciation et inversement r´egul´es lors de la d´epl´etion de DDX5/DDX17 et dans la DM1.

IV. R ˆOLE DE DDX5/DDX17 DANS LES D ´EFAUTS D’ ´EPISSAGE OBSERV ´ES

DANS LA DM1 ? 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

Figure39: Ev´enements d’´epissage r´egul´es au cours de la diff´erenciation et inversement r´egul´es lors de la d´epl´etion de DDX5/DDX17 et dans la DM1.Mb : Myoblastes.

Parmi ces ´ev`enements, certains g`enes sont particuli`erement int´eressant de part leur fonction :

– ABLIM1 : Ce g`ene code pour une prot´eine LIM cytosquelettique, capable de lier les filaments d’actine. Les prot´eines LIM sont connues comme des r´egulateurs du d´eveloppement embryonnaire (Hobert and Westphal, 2000). En particulier, ABLIM1 a ´et´e impliqu´e dans le d´eveloppement de la r´etine (Roof et al., 1997). Les patients atteints de DM1 pr´esentent souvent des cataractes ainsi qu’une d´eg´en´erescence de la r´etine. Ce g`ene apparaˆıt donc fonctionnellement int´eressant. – BIN1 : Ce g`ene code pour une prot´eine n´ecessaire `a la biog´en`ese des tubules

T musculaires, n´ecessaires au couplage excitation-contraction dans les cellules musculaires. En particulier, un variant d’´epissage (autre que celui d´ependant de DDX5/DDX17) a ´et´e r´ecemment identifi´e comme participant activement au ph´enotype de la DM1 (Fugier et al., 2011). Les patients pr´esentent un saut de l’exon 11 qui est responsable d’une forme inactive de la prot´eine, directement associ´ee `a une faiblesse musculaire, qui constitue le principal symptˆome de la DM1.

– ITGB1 : Ce g`ene code pour l’int´egrine beta-1 qui est impliqu´ee dans la vascularisation et l’innervation du muscle squelettique (Schwander et al., 2004). De plus, le variant d’´epissage contenant l’exon r´egul´e par DDX5/DDX17 a ´et´e identifi´e comme sp´ecifique du muscle (Belkin et al., 1996). Cet exon, lorsqu’il est inclus, conf`ere `a la prot´eine des propri´et´es d’attache `a la matrice cytosquelettique, capacit´e n´ecessaire pour assurer la fonction de contraction des cellules musculaire. – MYOM1 : Ce g`ene code pour une prot´eine structurale des bandes M des fibres musculaires impliqu´ees dans l’´elasticit´e musculaire (Speel et al., 1998; Pinotsis et al., 2012). Ce variant a r´ecemment ´et´e montr´e comme ´etant d´er´egul´e dans la DM1 de mani`ere d´ependante `a MBNL1 (Koebis et al., 2011).

– NUMB : Ce g`ene est impliqu´e dans le contrˆole de la division asym´etrique et dans la d´etermination cellulaire, en particulier neuronale (Casanova, 2007). L’exon r´egul´e par DDX5/DDX17 est sp´ecifique des cellules en prolif´eration non diff´erenci´ees, le saut d’exon ´etant n´ecessaire `a l’entr´ee en diff´erenciation (Yan, 2010; Bani-Yaghoub et al., 2007). Les patients atteints de DM1 pr´esentent des troubles neurologiques importants et de plus en plus d’´etudes montrent une d´er´egulation importante des programmes d’expression dans le cerveau des patients DM1.

C 2`eme cat´egorie d’exons

Nous avons montr´e que l’expression de DDX5/DDX17 diminue au cours de la diff´erenciation et que cette diminution contribue probablement aux changements dans le programme d’´epissage exprim´e par les cellules au cours de la myogen`ese.

IV. R ˆOLE DE DDX5/DDX17 DANS LES D ´EFAUTS D’ ´EPISSAGE OBSERV ´ES

DANS LA DM1 ? 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

Nous avons donc cherch´e `a identifier les ´ev´enements d’´epissage r´egul´es de la mˆeme fa¸con au cours de la diff´erenciation et suite `a l’inactivation de l’expression de DDX5/DDX17 dans des cellules non diff´erenci´ees. Ce type d’´ev`enement d’´epissage correspondrait, dans notre mod`ele, `a des ´ev´enements survenant plus tardivement dans la diff´erenciation et r´esultant de la baisse d’expression de DDX5/DDX17 induite par les miRNAs miR-1/206.

Ont ´et´e s´electionn´es les ´ev´enements r´egul´es durant la diff´erenciation dans au moins l’un des deux mod`eles (myoblastes C2C12 et myoblastes humains) mais r´egul´es par la d´epl´etion de DDX5/DDX17 et inversement dans la DM1 (Tableau 7, Figure 40).

Prot´eine Description Fonction EPB41L3 Erythrocyte membrane protein

band 4.1-like 3

Prot´eine r´egulatrice de la croissance celllulaire dans la p´ethog´en`ese des m´eningiomes.

KIAA1797 Focadh´esine Potentiel suppresseur de tumeurs dans les gliomes.

KIF1B Kinesin family member 1B Prot´eine moteur pour le transport ant´erograde de la mitochondrie et des v´esicules synaptiques. Sa fonction a ´et´e essentiellement ´etudi´ee dans les cellules neuronales.

MKNK1 MAP kinase interacting serine/threonine kinase 1

Prot´eine jouant potentiellement un rˆole dans la r´eponse au stress environnemental et les cytokines.

PPP3CA Prot´eine phosphatase 3, catalytic subunit, alpha isozyme

Sous-unit´e catalytique de la calcineurine, prot´eine r´egulatrice

de la

diff´erenciation myog´enique (par activation de l’expression de MyoG et MEF2A). La calcineurine est ´egalement un senseur du calcium intra-cellulaire.

TJP1 Tight junction protein 1 Prot´eine impliqu´ee dans la transduction du signal n´ecessaire `

a l’assemblage des jonctions serr´ees. Joue un rˆole dans la migration cellulaire.

TRIM55 Tripartite motif containing 55 Prot´eine jouant potentiellement un rˆole dans l’expression g´enique et le taux de renouvellement prot´eique dans les cellules musculaires.

Table7: G`enes dont l’´epissage est r´egul´e au cours de la diff´erenciation ainsi que lors de la d´epl´etion de DDX5/DDX17 et inversement r´egul´es dans la DM1.

Figure40: Ev´enements d’´epissage r´egul´es au cours de la diff´erenciation, de la mˆeme mani`ere lors de la d´epl´etion de DDX5/DDX17 et inversement dans la DM1.Mb : Myoblastes.

D Perspectives

Ces r´esultats sont pr´eliminaires et certains aspects doivent, en particulier, ˆetre abord´es dans la suite du projet.

Dans l’hypoth`ese d’une coop´eration entre DDX5 et MBNL1, la prochaine ´etape est de d´eterminer si les ´ev´enements d’´epissage DDX5/DDX17-d´ependants s´electionn´es pr´ec´edemment sont r´egul´es de la mˆeme mani`ere par MBNL1. Des r´esultats pr´eliminaires, dans notre mod`ele cellulaire, nous indiquent n´eanmoins que peu de ces ´ev´enements apparaissent ´egalement d´ependants de MBNL1. Ces r´esultats peuvent avoir plusieurs explications. D’une part, notre d´emarche n’a aboutit qu’`a un faible

IV. R ˆOLE DE DDX5/DDX17 DANS LES D ´EFAUTS D’ ´EPISSAGE OBSERV ´ES

DANS LA DM1 ? 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

nombre d’´ev´enements `a tester. Il n’est donc pas possible de conclure quand `a un m´ecanisme g´en´eral de r´egulation. D’autre part, il existe une redondance fonctionnelle entre prot´eines MBNL, en particulier entre MBNL1 et MBNL2, qui pr´esentent le mˆeme profil d’expression (Carpentier et al.,2014). Il est donc n´ecessaire d’effectuer une double d´epl´etion `a la fois de MBNL1 et MBNL2 afin d’observer les effets sur l’´epissage des exons candidats.

Le faible nombre d’´ev´enements s´electionn´es par notre d´emarche nous montre que celle-ci est trop stringente. De nombreux ´ev´enements potentiellement int´eressant ont ´et´e ´elimin´es lors des diff´erentes ´etapes de s´election. Un exemple de ce type d’´ev´enements d’´epissage perdu est le ≪ switch ≫ d’´epissage de la PKM (Pyruvate Kinase Muscle), enzyme du m´etabolisme du glucose. En l’absence de DDX5 et DDX17, l’isoforme fœtale PKM2 est r´eexprim´ee. Tr`es r´ecemment une ´etude a identifi´e cet ´ev´enement d’´epissage comme d´er´egul´e dans la DM1 entraˆınant des d´efauts dans le m´etabolisme ´energ´etique (Gao and Cooper, 2013b).

D’autre part, on sait que le mod`ele cellulaire C2C12 ne reproduit pas `a l’identique la myogen`ese se produisant dans les myoblastes primaires humains (Cornelison,1998). L’une des difficult´es observ´ees lors de l’´etape de validation a ´et´e le fait que certains ´ev´enements r´egul´es au cours de la myogen`ese dans les C2C12 ne l’´etaient pas dans celle des myoblastes humains (et vice-versa). Ce constat nous a d’ailleurs amen´e `a conserver les ´ev´enements r´egul´es durant la diff´erenciation `a la fois de l’un ou l’autre mod`ele.

Il est donc n´ecessaire de faire des efforts sur notre≪ workflow≫ d’analyse de puces

≪ tout exon ≫ afin d’enrichir au maximum nos listes d’exon candidats, tout en gardant conscience de la limitation de certains de nos jeux de donn´ees. Ainsi l’objectif serait d’avoir le maximum d’´ev´enements fiables `a tester dans un premier temps dans notre mod`ele cellulaire (dans lequel il nous est possible de tester la d´epl´etion d’une s´erie de facteurs d’´epissage tels que MBNL1 +/- MBNL2, hnRNP H. . .) puis dans un deuxi`eme temps, dans un mod`ele DM1 de diff´erenciation.

Les candidats valid´es dans ces diff´erentes conditions, apparaissant particuli`erement int´eressants fonctionnellement, pourront faire l’objet d’une ´etude fonctionnelle pr´eliminaire dans notre laboratoire, `a l’aide d’approches visant `a comprendre

la fonction des exons impliqu´es dans les produits prot´eiques correspondant. Par exemple, l’approche oligoswitch nous permet de forcer l’expression d’un variant en particulier. A la diff´erence des siARNs qui peuvent entraˆıner un d´eficit d’expression, ces oligonucl´eotides antisens ciblent les jonctions intron-exon ou les s´equences cis-r´egulatrices afin de forcer l’´epissage d’un pr´e-ARNm.

Un autre aspect `a exploiter serait de d´eterminer le profil d’expression chez les patients DM1. En effet, le facteur d’´epissage CUGBP1 est hyperphosphoryl´e chez les patients DM1, rendant ce facteur plus stable et entraˆınant une augmentation de son expression. Cette hyperphosphorylation est m´edi´ee par PKC (Prot´eine Kinase C) par un m´ecanisme encore inconnu (Wang et al., 2007). On sait que DDX5 est aussi une cible de PKC et qu’elle peut ˆetre phosphoryl´ee en S557 (Buelt et al., 1994). Si l’impact de cette modification post-traductionnelle n’est pas encore connue, il apparaˆıt int´eressant de d´eterminer si elle survient chez les patients DM1 et si elle a un impact sur l’expression et/ou l’activit´e de DDX5. Si c’est le cas, l’impact sur les programmes d’expression g´eniques peut ˆetre tr`es important et apporte d’autant plus de relevance `a l’´etude de ces deux prot´eines dans le contexte de la DM1. De mani`ere g´en´erale, il est particuli`erement important de d´eterminer l’expression de DDX5 chez les patients DM1 et d’autant plus durant la myogen`ese. Ainsi si le profil d’expression n’est pas le mˆeme que lors de la myogen`ese normale, ceci peut contribuer aux d´efauts de diff´erenciation observ´es dans la DM1.

Enfin, nous nous sommes focalis´es sur l’impact de DDX5 et DDX17 sur l’´epissage dans la pathologie de la DM1. On sait aujourd’hui que celle-ci pr´esente ´egalement une d´er´egulation massive de l’expression des micro-ARNs (Kalsotra et al.,2014). Les prot´eines DDX5 et DDX17 ont ´et´e impliqu´e dans la biog´en`ese des miARNs, il serait donc int´eressant d’´etudier leur rˆole dans l’alt´eration de la biog´en`ese des miARNs observ´ee dans la DM1. En particulier, une ´etude r´ecente a montr´e que le processing de miR-1 est d´er´egul´e chez les patients DM1 (Rau et al., 2011). Dans un contexte sain, MBNL1 se fixe sur la boucle que forme le pr´e-miARN empˆechant un facteur inhibiteur de se fixer. Dans la DM1, suite `a sa perte de fonction, MBNL1 n’est plus en mesure d’assurer ce rˆole entraˆınant une chute de l’expression du miR-1 mature. Mˆeme si l’on ne montre, dans notre mod`ele, qu’un rˆole strictement transcriptionnel

IV. R ˆOLE DE DDX5/DDX17 DANS LES D ´EFAUTS D’ ´EPISSAGE OBSERV ´ES

DANS LA DM1 ? 4. R ´ESULTATS COMPL ´EMENTAIRES

de DDX5/DDX17 sur l’expression de miR-1, on ne peut pas exclure un rˆole dans la maturation d’autres miARNs.