Le r´esultat de l’int´egration num´erique avec ce couple critique de formation des plecton`emes et les mˆemes param`etres que pr´ec´edemment est montr´e sur la fi-gure IV.14, courbe rouge. On voit que les deux courbes issues du mod`ele se super-posent pour une concentration inf´erieure `a 150nM. Mais lorsque la vitesse atteint la valeur correspondant au couple critique, alors la courbe rouge (avec plecton`emes) sature en formant un angle net, et la vitesse reste constante pour les concentra-tions plus ´elev´ees. Ceci correspond beaucoup mieux au comportement de la courbe exp´erimentale (cercles bleus).
La variation des deux seuls param`etres inconnus (K1 et p) ne modifie que tr`es peu la partie de la courbe aux concentrations faibles. La saturation ne d´epend que d’un seul param`etre : le couple critique. Ainsi ce mod`ele ajuste bien les donn´ees exp´erimentales sans aucun ajustement de param`etre libre. Cette mod´elisation nous permet de conclure que la saturation de la vitesse de rotation avec la concentration
est due `a la formation de plecton`emes. Le mod`ele ajuste tr`es bien la premi`ere partie de la courbe avec les param`etres de la litt´erature, sans jouer sur aucun autre para-m`etre libre, cela montre que notre exp´erience est fiable et que l’on peut en tirer des r´esultats quantitatifs.
Remarque La pente de la courbe simul´ee n’est pas continue lorsque l’on atteint le couple critique. Mˆeme si les points exp´erimentaux ne nous permettent pas de comparer ce point pr´ecis, il est tr`es probable que la courbe exp´erimentale compl`ete montre une transition sans discontinuit´e de la pente. En effet, dans notre mod`ele, l’agitation thermique de l’ADN n’est pas prise en compte. Ceci a pour effet qu’`a une concentration donn´ee corresponde un couple pr´ecis, alors que dans la r´ealit´e ce couple Γ(C) doit ˆetre bruit´e entraˆınant une transition plus douce.
4 Potentiel chimique au couple d’arrˆet
A partir du mod`ele d´ecrit dans la partie 3 et de la mesure du couple d’arrˆet, on peut essayer de d´eduire la valeur du potentiel chimique de la polym´erisation de hRAD51. On reprend le syst`eme d’´equation qui figure page110. Si l’on est au couple d’arrˆet de la polym´erisation alors :
1. la bille ne tourne plus, c’est-`a-dire dθ/dt = 0 2. le filament ne croˆıt plus, c’est-`a-dire dz1/dt = 0.
L’affirmation 1 ci-dessus implique que l’´equation IV.16adevienne :
M B sin(θ) = −K0(a0− q0). (IV.18) De mˆeme, la deuxi`eme affirmation implique, `a partir de l’´equation IV.16b:
kb0 k0 u = 1 Ce ∆µ/kBT . (IV.19)
Les ´equations IV.18et IV.16cpermettent d’exprimer le potentiel chimique en fonc-tion du couple d’arrˆet :
∆µ = lrad 2 (M B sin θ)2 K0 − K1(a1− q1)2 . (IV.20)
A ce point, on est oblig´e de faire une hypoth`ese suppl´ementaire puique l’on ne connaˆıt par la valeur du terme d’´energie en torsion dans le filament. On suppose que le filament est infiniment rigide et que, par cons´equent, la torsion dans le fila-ment est ´egale `a celle `a l’´equilibre. Ainsi ce terme ´energ´etique est nul, et on obtient
une expression du potentiel chimique qui ne d´epend que du couple d’arrˆet et des grandeurs connues :
∆µ = lrad
2K0(M B sin θ)
2. (IV.21)
Finalement on peut injecter cette expression du potentiel chimique dans l’´ equa-tion IV.19, on obtient :
k0 b k0 u = 1 Cexp lrad 2K0kBT(M B sin θ) 2 . (IV.22)
Avec les valeurs utilis´ees dans l’int´egration num´erique pour lrad,K0,kBT , avec la concentration en hRAD51 qui vaut 250nM dans cette exp´erience et M B sin θ = Γmax = 16 ± 2 pN · nm, l’application num´erique donne :
k0 b
k0 u
= 4,8.106± 0,5 M−1. (IV.23) Dans le premier chapitre (tableau figureI.5, page17), on a vu que ce rapport entre les constantes d’association et de dissociation de hRAD51 est estim´e `a 5,7.106± 1 M−1
en pr´esence d’ATPγS. Nous obtenons donc une valeur tout `a fait compatible avec les r´esultats obtenus par des exp´eriences d’enzymologie. Ceci confirme l’hypoth`ese que l’on mesure effectivement le couple d’arrˆet de la polym´erisation de hRAD51 et non pas le couple critique de formation des plecton`emes.
D Exp´eriences tent´ees
1 Polym´erisation avec des analogues non-hydrolysables de
l’ATP.
On souhaite ´etudier l’activit´e de la recombinase hRAD51 et en particulier dres-ser le panorama ´energ´etique de la r´eaction de recombinaison homologue. hRAD51 est une ATPase, elle est capable d’hydrolyser l’ATP dans une r´eaction qui d´egage de l’´energie. Il est donc int´eressant de bloquer cette source d’´energie et d’´etudier le comportement de la prot´eine. On sait par des ´etudes en solution, qu’en pr´esence d’analogues non-hydrolysables de l’ATP, hRAD51 est toujours capable de polym´ eri-ser sur l’ADN et d’´echanger les brins. Cependant, d’apr`es des ´etudes de microscopie ´
electronique notamment (voir chapitre 1, p.16), le filament form´e avec ces analogues d’ATP ne pr´esente pas la mˆeme structure avec un pas h´elical plus court. En observant la polym´erisation de hRAD51 sans hydrolyse de l’ATP dans nos pinces magn´etiques sensibles au couple, nous pourrons comparer la torsion induite et l’´energie produite par la prot´eine par rapport aux conditions (( normales )). Ces exp´eriences ont ´et´e r´ealis´ees deux fois en pr´esence d’ATPγS (analogue tr`es faiblement hydrolysable), et une fois seulement en pr´esence d’AMP-PNP (analogue non hydrolysable).
(a) (b)
Figure IV.15 – Polym´erisation en pr´esence d’ATPγS, analogue tr`es faiblement hydrolysable de l’ATP.(a) Position angulaire de la bille en fonction du temps. (b) Analyse (( pairwise )) correspondante.