Pour l'étude de l'activité bactérienne, les méthodes de réalisation des essais doivent éviter toute contamination par des microorganismes non désirés. Le matériel, la réalisation des milieux de culture et les conditions de croissance doivent respecter cet impératif. Les diérentes méthodes de stérilisation et de réalisation des milieux sont détaillés en annexe D.
Les deux souches bactériennes utilisées, Bacillus cohnii et Bacillus pseudo rmus, pro- viennent de la collection de culture de microorganismes de l'entreprise DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. Les bactéries sont stockées sous forme de cryotube à -80C. Un cryotube contient 1 mL de suspension bactérienne en phase ex- ponentielle de croissance et 0,5 mL de glycérol (1/4).
Les milieux initiaux testés sont les milieux de culture recommandés par le fournisseur des souches bactériennes DSMZ. Puis, diérents paramètres ont été testés pour aboutir à un milieu de culture permettant une croissance optimale de la souche sélectionnée et la formation de quantités signi catives de précipités.
4.3.1 Méthodes d'analyses microbiologiques
Les essais de croissance bactérienne consistent à ensemencer et à suivre l'activité bacté- rienne dans les milieux de culture à étudier. L'évolution théorique et la description des diérentes phases d'une croissance bactérienne sont présentées en annexe C.
Les paramètres analysés sont les suivants : - Le pH ;
- La densité optique ;
- La taille de la population bactérienne par des comptages par épi uorescence ; - La Demande Biologique en Oxygène (DBO) ;
- La concentration en précurseurs par des dosages par chromatographie ionique ou par ICP.
Le développement des bactéries engendre un trouble dans le milieu de culture. La mesure de la turbidité de la solution peut se quanti er par des mesures d'absorbance (appelé aussi densité optique) à l'aide d'un spectrophotomètre. La longueur d'onde la plus appropriée pour évaluer la densité optique d'une solution contenant des microorganismes est commu- nément xée autour de 600 nm, soit la région spectrale des oranges. Pour cette étude, la longueur d'onde est xée à 620 nm. Les mesures régulières de densité optique permettent de mettre en évidence les diérentes phases de croissance bactérienne. Cette technique, bien que simple et facile à mettre en ÷uvre, présente certains biais, notamment lors de la formation de précipités dans les milieux. Les mesures de la turbidité ne sont alors plus représentatives du nombre de cellules bactériennes en solution.
Le comptage par épi uorescence est une méthode permettant d'estimer la concentration en bactéries et la proportion de cellules vivantes ou mortes [91]. Cette technique consiste à compter au microscope optique équipé en épi uorescence les bactéries recueillies sur une membrane en polycarbonate à pores cylindriques calibrés à 0,2 µm. L'utilisation d'un uorochrome, l'acridine orange, permet de diérencier les bactéries mortes des bactéries vivantes. À la lumière ultraviolette, l'acridine orange colore de façon spéci que les bactéries vivantes ou mortes, les cellules vivantes apparaissent en rouge, les mortes en vert. Les résultats sont exprimés en nombre de bactéries vivantes ou mortes par mL.
La chromatographie ionique est une technique qui permet d'isoler et de quanti er une substance chargée électriquement. Le principe repose sur les diérences de charge électrique et de masse entre les espèces chimiques. Ces diérences vont se traduire par une migration diérente dans les colonnes de séparation. Cette technique est utilisée pour doser le lactate et le gluconate, les deux précurseurs utilisés dans l'étude. Il est également possible de doser par cette technique l'acétate, le propionate et le formiate, qui pourraient se former dans les solutions suite à la dégradation des précurseurs. Pour les dosages avec la chromatographie ionique, le volume de la solution à analyser est ltré par un ltre de diamètre de pore de 0,2 µm. Les bactéries ainsi que les précipités formés sont éliminés, seuls les composés en solution sont dosés.
La spectrométrie d'émission optique à plasma à couplage inductif, ou, Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP-OES)2 est une technique d'analyse utilisée
pour déterminer les éléments chimiques présents en solution. La méthode consiste à ioni- ser l'échantillon en l'injectant dans un plasma. L'analyse de lumière émise par le plasma permet d'identi er et de quanti er les ions métalliques présents dans les solutions, tels que
le calcium dans le cas présent. De la même manière que pour les analyses à la chromato- graphie ionique les solutions à analyser sont ltrées.
Les organismes aérobies, consommant l'oxygène et dégageant du dioxyde de carbone, peuvent être suivis en mesurant leur consommation d'O2. Le système Oxitopr (WTW,
Wissenschaftlich-Technische-Werkstätten) est capable d'évaluer la demande biologique en oxygène (DBO).
Les milieux de culture sont ensemencés à partir d'une aliquote d'une pré-culture. Une pré-culture est une culture menée en erlemeyer refermant 100 mL de milieu recommandé, ensemencée à partir d'un cryotube et placé à 30C sous agitation. Pour les souches étudiées, le milieu recommandé est composé du milieu Nutrient Broth (NB) à 8 g/L. Le pH est ajusté à 9,6 avec une solution tampon (0,5 mol/L de NaHCO3 et 0,5 mol/L de Na2CO3). Pour
constituer un bon inoculum, la pré-culture doit être en phase exponentielle de croissance avec plus de 108 bactéries vivantes par mL au moment de l'ensemencement de la culture
bactérienne proprement dite.
Deux types d'essais de croissance bactérienne sont menés : - Des essais de croissance en erlenmeyers ;
- Des essais de croissance avec le système Oxitopr.
4.3.2 Essais de croissance bactérienne en erlenmeyers
Les essais menés en erlenmeyers permettent des prélèvements périodiques dans le milieu de culture. Il est possible de suivre, tout au long de la croissance bactérienne, l'évolution du pH, de la taille de la population bactérienne (par des mesures de densité optique et par des comptages par épi uorescence) et de la concentration en précurseurs (par des dosages en chromatographie ionique ou par ICP).
Ces essais ont été menés en erlenmeyers de 250 mL ou de 500 mL, contenant respectivement 100 mL ou 250 mL du milieu de culture à étudier. Les milieux sont inoculés avec un aliquote de la préculture en phase exponentielle de croissance, à un volume de 1/1000 par rapport au volume du milieu. Une fois inoculés, les milieux de culture sont incubés à la température souhaitée (30C ou 20C) sous agitation.
Certains milieux cultivés en erlenmeyers ne subissent par de prélèvement réguliers, ils sont ltrés en totalité à la n de l'essai ( ltration à 0,45 µm). Le précipité qui s'est formé dans
les milieux au cours de la croissance bactérienne est séché, pesé et analysé par analyse thermogravimétrique (ATG) ou par diractométrie de rayons X (DRX).
La DRX permet de dé nir la nature minéralogique et la structure cristallographique des constituants du matériau. C'est une technique d'analyse fondée sur la diraction des rayons X par la matière. L'échantillon analysé est bombardé de rayons X. L'intensité des rayons X diusés dans les diérentes directions de l'espace permet de caractériser la nature de la phase cristalline.
L'analyse thermogravimétrique (ATG) consiste à mesurer la perte de masse lors de l'élé- vation de la température de l'échantillon. Le carbonate de calcium (CaCO3) se décompose
à 800C en chaux vive (CaO) et en dioxyde de carbone (CO2). La perte de masse à cette
température doit correspondre à la masse de CO2 dégagé. La mesure de cette perte de
masse permet de déterminer la masse de carbonate de calcium initiale.
4.3.3 Essais de croissance bacterienne avec le système Oxitop
rLes essais utilisant le système Oxitopr permettent la mesure en continu de la consom-
mation de l'oxygène issue de l'activité des bactéries aérobies (Demande Biologique en Oxygène, DBO). Le système doit être hermétiquement scellé durant la période de mesure. Les prélèvements et les mesures ne sont possibles qu'avant et après la période de mesure de la DBO. Les essais sont menés en acons de 1 litre contenant 200 mL de milieu de culture et ensemencé avec 200 µL de pré-culture. Les têtes de mesure du système Oxitopr
sont alors immédiatement visées hermétiquement sur les acons et le système est placé à 30C sous agitation pendant toute la durée de l'expérimentation.
Les têtes de mesures enregistrent les variations de pression engendrées par la respiration bactérienne. Des pastilles de soude dans le capuchon piègent le CO2 dégagé par la res-
piration bactérienne ( gure 4.6). La mesure de la dépression créée par la consommation bactérienne de O2 permet d'obtenir la DBO ( exprimée en mg de O2 par litre). La DBO
est calculée par le système Oxitopr toutes les deux heures pour les essais d'un mois, et
toutes les 28 minutes pour les essais d'une semaine. Dans les deux cas, il est eectué 360 mesures tout au long de l'essai.
Cette méthode permet un suivi plus simple de l'activité bactérienne, sans besoin d'inter- vention entre le début et la n de l'essai. Cependant, aucun prélèvement intermédiaire n'est possible, en raison de la variation de pression que provoquerait l'ouverture des acons.
Figure 4.6 Système Oxitopr [Modi é de WTW]