3. MP+ Frame Formats
3.1 Error Control (EC) Layer
3.1.1 Error Control State Machine
A biotransformação da midodrina foi avaliada frente a três fungos em condições de agitação e estática. Estas diferentes condições foram testadas a fim de avaliar a influência da aeração dos cultivos, bem como, da morfologia de crescimento destes fungos. Em condição estática os fungos apresentam, em geral,
um crescimento homogêneo sobre a superfície do cultivo e em agitação observa-se a formação de agregados esféricos, chamados pellets (GIBBS; SEVIOUR; SCHMID, 2000). As reações de biotransformação dos fungos fitopatógenos estudados foram acompanhadas durante 7 dias (168 h), enquanto que a biotransformação pelo fungo endofítico foi monitorada durante 5 dias (120 h). Diariamente, alíquotas foram coletadas, extraídas e analisadas por cromatografia líquida. As concentrações dos analitos foram determinadas com base em curvas analíticas construídas diariamente. Após definidas as concentrações dos analitos, foram construídos gráficos com as curvas cinéticas de biotransformação dos fungos estudados (concentração x tempo de incubação). Os gráficos referentes à cinética de biotransformação da midodrina pelos três fungos em condição de agitação e estática são apresentados abaixo.
4.3.1. Papulaspora immersa Hotson (SS13)
A Figura C2-5 apresenta os resultados de biotransformação da midodrina em DMAE pelo fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13).
Figura C2-5. Gráfico da cinética de formação de DMAE e decaimento da
midodrina pelo fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13) em condição estática e em agitação. As barras expressam a estimativa do desvio padrão das replicatas (n=2).
O fungo Papulaspora immersa (SS13) apresentou maior biotransformação em condição de agitação quando comparado à condição estática. A quantidade máxima determinada em ambas as condições foi verificada em 120 horas de biotransformação (Figura C2-5). Em condição estática, a partir do segundo dia de biotransformação, foi observada a presença de um pico adicional (pico 3 da Figura
C2-6B) nas amostras biotransformadas o qual não foi detectado em nenhum dos
controles avaliados (Figura C2-6A). Além disso, sua área máxima foi detectada em 120 horas de biotransformação.
Figura C2-6. (A) Cromatograma representativo das amostras de meio de
cultura Czapek-Dox incubada com o fungo Papulaspora immersa (SS13) em condição estática. (B) Cromatograma representativo das amostras de meio de cultura Czapek-Dox incubada com o fungo Papulaspora immersa (SS13) e midodrina após 120 h de biotransformação em condição estática. As condições cromatográficas foram: Coluna Lichrospher 100 RP18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), fase móvel constituída por acetonitrila / ácido fórmico 40 mmol L-1 (60:40, v/v), vazão de 1,4 mL min-1, volume de injeção de 25 µL, detecção UV em 290 nm e
análise a temperatura ambiente. (1) midodrina, (2) DMAE e (3) composto desconhecido.
4.3.2. Botrytis cinerea linhagem UCA 992
Na Figura C2-7 podem ser observados os resultados da cinética de biotransformação da midodrina pelo fungo Botrytis cinerea (UCA 992).
Figura C2-7. Gráfico da cinética de formação de DMAE e decaimento
da midodrina pelo fungo Botrytis cinerea (UCA 992) em condição estática e de agitação. As barras expressam a estimativa do desvio padrão das replicatas (n=2).
O fungo Botrytis cinerea (UCA 992), da mesma maneira que o fungo Papulaspora immersa (SS13), apresentou maior biotransformação em condição de agitação quando comparado à condição estática. A quantidade máxima determinada em condição estática foi verificada em 168 horas de biotransformação (Figura C2-7), apresentando o maior percentual de biotransformação para esta condição entre os três fungos estudados (11,52%). Em condição de agitação o máximo de biotransformação foi verificado já em 96 horas de biotransformação (29,25%). Nas biotransformações conduzidas com este fungo não foi detectada a presença de nenhum pico adicional nas amostras biotransformadas.
4.3.3. Botrytis cinerea linhagem 2100
A Figura C2-8 apresenta os resultados da cinética de biotransformação da midodrina pelo fungo Botrytis cinerea (2100). Assim como para os demais fungos estudados, o fungo Botrytis cinerea (2100) apresentou as melhores taxas de biotransformação em condição de agitação. A máxima quantidade de DMAE quantificada, no meio de cultivo, em condição de agitação, foi observada após 48
horas de biotransformação e consiste na condição que apresentou o melhor rendimento de DMAE entre as condições avaliadas neste estudo (42,2%). Por outro lado, em condição estática a máxima quantidade biotransformada foi observada em 72 horas de biotransformação (8,92%). Vale ressaltar que após 72 horas de incubação, praticamente toda midodrina havia sido biotransformada. Como a máxima porcentagem de midodrina obtida foi 42,2 %, sugere-se que outros metabólitos não detectados foram formados. Por outro lado, em condição estática foram observados três picos adicionais (picos 3, 4 e 5 Figura C2-9B), aos esperados (picos da midodrina e DMAE), em amostras submetidas a biotransformação por 48 horas. Esses picos não foram observados em nenhum dos controles avaliados
(Figura C2-9A) e, após sua detecção, em 48 h, suas áreas não sofreram alteração
durante o período do estudo. Esses picos adicionais formados podem ser considerados possíveis metabólitos da midodrina.
Figura C2-8. Gráfico da cinética de formação de DMAE e decaimento da
midodrina pelo fungo Botrytis cinerea (2100) em condição estática e de agitação. As barras expressam o desvio padrão das replicatas (n=2).
Figura C2-9. (A) Cromatograma representativo das amostras de meio
de cultura Czapek-Dox incubada com o fungo Botrytis cinerea (2100) em condição estática. (B) Cromatograma representativo das amostras de meio de cultura Czapek-Dox incubada com o fungo Botrytis cinerea (2100) e midodrina após 48 h de biotransformação em condição estática. As condições cromatográficas foram: Coluna Lichrospher 100 RP18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), fase móvel constituída por acetonitrila / ácido fórmico 40 mmol L-1 (60:40, v/v), vazão de 1,4 mL min-1, volume de injeção de 25 µL, detecção UV em 290 nm e análise a temperatura ambiente. (1) midodrina, (2) DMAE, (3, 4 e 5) compostos desconhecidos.
A reação observada na biotransformação da midodrina em DMAE consiste em uma hidrólise do grupo funcional amida. Esta reação com Botrytis cinerea foi também observada por Tellier et al. (2004).
O fungo Botrytis cinerea vem sendo empregado em diversas biotransformações principalmente de produtos sintéticos (BUSTILLO et al., 2003; DAOUBI et al., 2005; DURAN et al., 1999; DURÁN-PATRÓN et al., 2000; PINEDO- RIVILLA et al., 2011) e naturais (ALEU et al., 2001b; NUÑEZ et al., 2006) com potencial atividade fungistática e fungicida.
A Tabela C2-12 apresenta o tempo de máxima formação da DMAE. O percentual de DMAE formado foi calculado considerando como 100% de biotransformação a concentração de midodrina quantificada no tempo 0 (alíquota coletada logo após a adição do fungo e fármaco ao meio de cultura) de biotransformação.
Tabela C2-12. Quantidade máxima de DMAE formada (expressa em % de
fármaco adicionada).
Fungo Condição Tempo (horas) % DMAE formada
Bc 2100 Agitação 48 42,20 Bc UCA 992 Agitação 96 29,25 Bc UCA 992 Estático 168 11,52 Bc 2100 Estático 72 8,92 SS 13 Agitação 120 7,96 SS13 Estático 120 7,36
4.4. Biotransformação da midodrina em escala ampliada
Após avaliação da cinética de biotransformação pelos fungos Papulaspora immersa Hotson, Botrytis cinerea UCA 992 e 2100 observou-se que para o primeiro e o último, em condição estática, havia a presença de picos adicionais nos cromatogramas. Com esta informação decidiu-se realizar a biotransformação da midodrina em escala ampliada, nessas condições e pelo período de tempo onde foi detectada a área máxima dos picos não identificados. Particularmente, para o fungo Papulaspora immersa Hotson, a biotransformação foi feita durante 5 e 10 dias, já que a área do pico não identificado aumentou desde o terceiro dia, quando foi observado pela primeira vez até o quinto e último dia de monitoramento.
4.4.1. Biotransformação com Papulaspora immersa Hotson durante 5 dias
Entre as frações avaliadas a F2.5 (4,2 mg) foi a única que apresentou manchas com fator de retardamento (RF) e sinais de RMN de 1H semelhantes ao
precursor (midodrina) e foi submetida à purificação por cromatografia líquida de alta eficiência empregando coluna semipreparativa. Após purificação da fração F2.5 foi obtida massa muito pequena do produto, o que inviabilizou sua caracterização estrutural.
As frações F3 (48,8 mg) apresentou manchas com RF e sinais de RMN de 1H
semelhantes ao precursor (midodrina). A fração F3 foi submetida à purificação por cromatografia líquida de alta eficiência empregando coluna semipreparativa, porém a massa isolada dos compostos foi muito pequena, não permitindo sua caracterização estrutural.
4.4.3. Biotransformação com Botrytis cinerea 2100
As frações F5 (18,9 mg) e F6 (6,92 mg) apresentaram manchas com fator de retardamento (RF) e sinais de RMN de 1H semelhantes entre si e ao precursor
(midodrina). Dessa maneira foram combinadas e submetidas à purificação por cromatografia líquida de alta eficiência empregando coluna semipreparativa (Figura
C2-10).
Figura C2-10. Cromatograma obtido durante a purificação das frações F5 + F6. As
condições cromatográficas foram: coluna semipreparativa Lichrospher 10 RP-18 (10 µm) 250 x 10 mm, fase móvel constituída por água / metanol (70:30, v/v + 0,06% de ácido fórmico), vazão de 2,5 mL min-1, volume de injeção de 100 µL, detecção em 290 nm, análise a temperatura ambiente. (1) composto isolado.
A quantidade isolada do composto 1, foi 2,4 mg o que representa um rendimento de 2,2%. Em busca realizada no Scifinder scholar não foi encontrado descrição na literatura para a estrutura proposta para o composto.
O composto 1 foi obtido como um sólido branco; [ ]25
α
D: + 2,0°; IR Vmax (filme):
3358, 1637, 1496, 1213, 1044 cm−1; MS m/z (intensidade relativa): 239 (M+, 5), 221 (M+−18, 24), 180 (58), 167 (91), 139 (65), 123 (35), 73 (54). Os dados espectroscópicos de RMN de 1H e de 13C estão apresentados na Tabela C2-13.
Tabela C2-13. Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) e RMN de 13C
(100 MHz) do composto 1 (δ, CD3OD). RMN de 13C RMN de 1H Posição δ (ppm) Posição δ (ppm) C1 155,2 H2 6,77 (dd, J 3,1; 9,0 Hz; 1H) C2 113,8 H3 7,03 (d, J 9,0 Hz; 1H) C3 112,5 H6 6,85 (d, J 3,1 Hz; 1H) C4 151,8 H7 5,06 (q, J 3,8 Hz; 1H) C5 132,8 H8α 3,31 (dd, J 7,7; 13,58 Hz; 1H) C6 113,8 H8β 3,41 (dd, J 4,1; 13,58 Hz; 1H) C7 68,3 H10 1,91 (s; 3H) C8 46,8 H11 3,77 (s; 3H) C9 173,7 H12 3,74 (s; 3H) C10 22,4 C11 56,0 C12 56,3
5. COMENTÁRIOS FINAIS
Neste capítulo foram mostrados os resultados obtidos com o desenvolvimento e validação de um método para a determinação simultânea de midodrina e DMAE por HPLC e detecção por absorção no ultravioleta empregando modo de eluição em fase reversa. Este método é mais simples que o proposto por Posch e Lindner (1989) que emprega um detector de fluorescência e técnica de preparo de amostra empregando column-switching. O método desenvolvido foi validado através da avaliação dos seguintes parâmetros: linearidade, limite de quantificação, seletividade, precisão, exatidão e estabilidade, cumprindo com os requisitos estabelecidos pela legislação.
Após sua validação, o método foi empregado em um estudo de biotransformação com um fungo endofítico Papulaspora immersa Hotson (SS13) e outras duas linhagens do fungo fitopatógeno Botrytis cinerea (UCA 992 e 2100). A biotransformação com os fungos foi conduzida em condições de agitação e estática. Para todos os fungos, a condição de agitação proporcionou maior produção de DMAE com destaque para o fungo Botrytis cinerea (2100). Por sua vez, as biotransformações com o fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13) e o fungo Botrytis cinerea (2100) em condição estática forneceram picos adicionais aos esperados e não encontrados nos controles realizados.
Estas condições foram empregadas para realizar experimentos de biotransformação em escala ampliada visando o isolamento dos compostos. A biotransformação pelo fungo Papulaspora immersa não forneceu nenhum produto com massa suficiente para realizar sua caracterização. Por sua vez, o fungo Botrytis cinerea biotransformou a midodrina em um derivado desaminado, não descrito na literatura, com um rendimento de 2,2%.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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