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4.2.1. Membrana cilíndrica oca

As membranas disponíveis em nosso laboratório estão entre as mais empregadas. Suas dimensões são: 600 µm de diâmetro interno, parede com 200 µm de espessura, o que fornece estabilidade mecânica durante a extração e poros com tamanho de 0,2 µm que permitem a microfiltração de macromoléculas (proteínas). Além disso, seu material de constituição, polipropileno, apresenta hidrofobicidade e

compatibilidade com os solventes orgânicos empregados (DE OLIVEIRA et al., 2008). O comprimento da membrana utilizada (15 cm) foi definido devido a sua facilidade de manuseio e adequação ao frasco e configuração da unidade extratora.

4.2.2. Seleção do solvente

Um importante parâmetro a ser avaliado durante o desenvolvimento de um método de extração por HF-LPME, tanto no modo de duas fases como no modo em três fases, é a seleção de um solvente orgânico adequado (PSILLAKIS; KALOGERAKIS, 2003). Um solvente orgânico adequado deve ser insolúvel em água, ter elevada afinidade pelo material da membrana e ter seletividade pelos analitos (RASMUSSEN; PEDERSEN-BJERGAARD, 2004).

O bufuralol e seus metabólitos 1’-oxobufuralol e 1’-hidroxibufuralol são substâncias de caráter básico e apresentam polaridade intermediária, já que seus logP são respectivamente, 3,37, 1,83 e 1,55. Essas características físico-químicas recomendam o uso da HF-LPME no modo de três fases.

Na avaliação do solvente extrator foram selecionados solventes de três funções químicas diferentes: n-octanol, éter hexílico e acetato de dodecila.

Conforme mostra a Figura C3-5, os solventes, éter hexílico e acetato de dodecila apresentaram os melhores resultados de recuperação para os enantiômeros do bufuralol. Para os enantiômeros do 1’-oxobufuralol, os resultados de recuperação foram semelhantes, porém uma maior variabilidade foi observada com o solvente acetato de dodecila. Por sua vez, o metabólito 1’-hidroxibufuralol apresentou os melhores resultados de recuperação com o solvente n-octanol. Devido ao n-octanol apresentar os melhores resultados de recuperação para os dois metabólitos foi o solvente selecionado para os estudos posteriores.

Figura C3-5. Seleção do solvente orgânico. Condições de extração: tempo de

extração de 30 minutos, velocidade de agitação de 1750 rpm, HCl 0,1 mol L-1 como fase aceptora, tampão borato 0,1 mol L-1_{, pH 10 como fase doadora.}

Concentração de cada estereoisômero: 1 µg mL-1. As análises foram realizadas em triplicata.

4.2.3. Seleção da fase aceptora

O emprego da HF-LPME em três fases na extração de analitos de caráter básico requer que o pH da fase aceptora esteja na faixa ácida, diferentemente da fase doadora que deve estar na faixa básica. Essa configuração permite a eficaz protonação dos analitos evitando o seu retorno para a fase orgânica, favorecendo a partição na fase aceptora aquosa. Neste modo em três fases, empregado na extração de analitos básicos, diversas soluções ácidas vem sendo usadas como fases aceptoras: ácido clorídrico, ácido acético, ácido fórmico, ácido nítrico, ácido sulfúrico e ácido trifluoracético (DE OLIVEIRA et al., 2008). Neste trabalho, os ácidos avaliados como soluções aceptoras foram: ácido perclórico, ácido trifluoracético, ácido acético e ácido clorídrico na concentração de 0,1 mol L-1_{. A Figura C3-6}

mostra que a fase aceptora que apresentou melhor recuperação para todos os analitos foi o ácido acético 0,1 mol L-1 _{e foi a fase aceptora selecionada para os}

estudos seguintes. Soluções de ácidos fortes como clorídrico e sulfúrico, por fornecerem pHs mais baixos, em geral, conferem melhores resultados de recuperação, quando comparadas a soluções de ácidos fracos, como fórmico ou

acético (PEDERSEN-BJERGAARD; HO; RASMUSSEN, 2002). Neste trabalho e em outros descritos na literatura (SANTANA; BONATO, 2008; FONSECA; BONATO, 2010) foi observado resultado oposto.

Figura C3-6. Seleção da fase aceptora. Condições de extração: tempo de

extração de 30 minutos, velocidade de agitação de 1750 rpm, n-octanol como solvente orgânico, tampão borato 0,1 mol L-1, pH 10 como fase doadora. Concentração de cada estereoisômero 1 µg mL-1_{. As análises foram realizadas}

em triplicata.

4.2.4. Seleção da concentração do ácido acético

A concentração da fase aceptora (solução de ácido acético) foi avaliada na faixa de 0,05 – 0,2 mol L-1. A concentração de 0,2 mol L-1 forneceu as melhores recuperações dos analitos, conforme pode ser observado na Figura C3-7 e foi adotada para os próximos experimentos.

Figura C3-7. Seleção da concentração do ácido acético (fase aceptora).

Condições de extração: tempo de extração de 30 minutos, velocidade de agitação de 1750 rpm, n-octanol como solvente orgânico, tampão borato 0,1 mol L-1_{, pH 10 como fase doadora. Concentração de cada estereoisômero 1}

µg mL-1. As análises foram realizadas em triplicata.

4.2.5. Seleção do pH da fase doadora

O controle do pH da amostra é fundamental para a eficiente extração tanto de compostos ácidos como básicos (DE OLIVEIRA et al., 2008). O pH da amostra deve ser ajustado a valores onde os analitos estejam não-ionizados, reduzindo sua solubilidade na fase aquosa e melhorando sua solubilidade no solvente orgânico. Assim, estes analitos são extraídos da fase doadora através do solvente orgânico presente nos poros da membrana cilíndrica oca. Na sequência passam ao lúmen da membrana e em seguida para a fase aceptora com pH oposto ao da fase doadora, que ioniza os analitos e não permite seu retorno para o solvente orgânico (RASMUSSEN; PEDERSEN-BJERGAARD, 2004).

O bufuralol (pKa 8,97), 1’-oxobufuralol (pKa 8,87) e 1’-hidroxibufuralol (8,92) são compostos de caráter básico, portanto o pH da fase doadora deve estar na faixa alcalina. Com isso, a influência do pH da fase doadora foi avaliada no intervalo de 10 a 13, conforme mostra a Figura C3-8.

Figura C3-8. Seleção do pH da fase doadora. Condições de extração: tempo de

extração de 30 minutos, velocidade de agitação de 1750 rpm, n-octanol como solvente orgânico, ácido acético 0,2 mol L-1 como fase aceptora; fase doadora em pH 10 (tampão borato 0,1 mol L-1_{), pH 12 (tampão fosfato 0,1 mol L}-1_{) e pH 13}

(250 µL de NaOH 2 mol L-1). Concentração de cada estereoisômero 1 µg mL-1. As análises foram realizadas em triplicata.

Pode-se observar aumento gradual na extração para os enantiômeros do bufuralol até pH 13, o que é observado em menor proporção para os metabólitos. Esse pH foi selecionado para a fase doadora.

4.2.6. Seleção da velocidade de agitação

A agitação das amostras é normalmente aplicada visando acelerar a cinética da extração. O aumento da velocidade de agitação aumenta a taxa de difusão dos analitos da fase doadora para a fase aceptora através do solvente orgânico, reduzindo-se o tempo para atingir o equilíbrio (PSILLAKIS; KALOGERAKIS, 2003). No experimento realizado (Figura C3-9), verifica-se aumento da recuperação dos metabólitos em 1750 rpm e uma pequena redução na recuperação dos enantiômeros do bufuralol e também, na variabilidade da extração, sendo esta a velocidade de agitação fixada para os próximos experimentos.

Figura C3-9. Seleção da velocidade de agitação. Condições de extração: tempo

de extração de 30 minutos, n-octanol como solvente orgânico, ácido acético 0,2 mol L-1 _{como fase aceptora, fase doadora em pH 13 (250 µL de NaOH 2 mol L}-1_).

Concentração de cada estereoisômero 1 µg mL-1. As análises foram realizadas em triplicata.

4.2.7. Seleção do tempo de extração

A eficiência da extração na HF-LPME depende da transferência de massa do analito da fase aquosa para a orgânica e desta para a fase aceptora (para o sistema de três fases). É um processo de equilíbrio e, portanto, a recuperação do analito aumenta com o tempo de extração até atingir uma situação de platô (DE OLIVEIRA et al., 2008). O tempo de extração foi avaliado no período de 15 a 60 min, no qual o equilíbrio foi alcançado em 30 min sendo o tempo selecionado para os experimentos subsequentes (Figura C3-10). A queda na recuperação em tempos superiores pode estar relacionada à perda do solvente orgânico da fibra, quando associam-se altas velocidades de agitação e elevados tempos de extração.

Figura C3-10. Seleção do tempo de extração. Condições de extração:

velocidade de agitação de 1750 rpm, n-octanol como solvente orgânico, ácido acético 0,2 mol L-1 _{como fase aceptora, fase doadora em pH 13 (250 µL de}

NaOH 2 mol L-1). Concentração de cada estereoisômero 1 µg mL-1. As análises foram realizadas em triplicata.

4.2.8. Parâmetros da HF-LPME otimizados

Os parâmetros da HF-LPME selecionados forneceram recuperações de aproximadamente 50, 64 e 69% para os estereoisômeros do bufuralol, 1’- hidroxibufuralol e 1’-oxobufuralol, respectivamente. Os parâmetros selecionados que forneceram estes resultados são apresentados na Tabela C3-3.

Tabela C3-3. Condições otimizadas para o procedimento de preparação das

amostras por HF-LPME.

Parâmetro avaliado Condição otimizada

Solvente orgânico n-octanol

Fase doadora pH 13 (250 µL NaOH 2 mol L-1) Fase aceptora ácido acético 0,2 mol L-1

Tempo de extração 30 min