Enquêteur 02 Poids (kg) 49,1±12,0 49,1±12,1

 Coloração de Gram

- Reagente: solução de violeta de cristal, solução de Lugol, solução de safranina, metanol, acetona; água reagente Grau I, soro fisiológico estéril.

- Equipamento: aparelho de coloração, bico de bunsen e vortex. O programa no aparelho de coloração corre na seguinte forma:

- Solução de cristal de violeta 90 segundos; - Lavagem com água 5 segundos;

- Solução de Lugol 90 segundos;

- Descoloração com solução álcool/acetona 30 segundos; - Lavagem com água 45 segundos;

- Solução de safranina 30 segundos; - Secagem da lâmina 4 minutos.

Deverá ser efetuado um controlo da coloração com duas estirpes: E. Coli 25922 e S. aereus 25923. Num tubo polistireno efetuar una suspensão das estirpes em soro fisiológico (±2 ml). Retirar 5 colónias (aproximadamente) de cada estirpe e agitar em vortex. Efetuar cerca de 50 lâminas com ajuda da ansa. Deixar secar e fixar à chama.

Estas lâminas são usadas como controlo da coloração e deverão ser usadas diariamente (uma lâmina) como coloração controlo.

- Resultados:

As bactérias são classificadas como Gram positivo e Gram negativo. Nas amostras podem aparecer também leucócitos (coram Gram negativo), células, formas parasitárias e leveduriformes. Quando não existem microrganismos no boletim deverá vir mencionado “Ausência de Microrganismo”.

A coloração de Gram é um teste que serve de diagnóstico presuntivo do agente infecioso e serve também para avaliar a qualidade da amostra e para orientar para a identificação definitiva.

 Testes de Catalase

- Amostra: colónias com 18 a 24h de incubação;

- Objetivo: Este teste permite distinguir Staphylococcus spp. que são catalase positiva e os Streptococcus spp. que são catalase negativa.

- Método:

Retirar as colónias do meio de cultura com uma ansa ou bastonete e colocá-las numa lâmina. Colocar 1-2 gotas de H2O2 3% junto às colónias. Misturar com o bastonete ou

ansa. Verificar se liberta O2 (pequenas bolhas).

Catalise positiva: liberta as bolhas de O2.

Catalise negativa: não liberta bolhas de O2.

 Teste para identificação de Staphylococcus aureus

- Amostra: colónias de uma cultura suspeita de S. aereus em meio de Columbia ou meio Chapman/manitol.

O S. aureus encontra-se frequentemente em patologias humanas. O reagente Slidex Staph Plus engloba partículas de látex azul sensibilizadas com fibrinogénio humano e com anticorpos monoclonais.

- Objetivo: Permite deteção simultânea do fator de afinidade para o fibrinogénio, da proteína A pelo fragmento Fc das IgG de rato e de um antigénio de grupo ligado às estruturas periféricas específicas do S. aureus.

 Teste oxidase

- Amostra: colónias com morfologia sugestiva, com 18 a 24h de incubação.

- Objetivo: Para separar Pseudomonadaceae (que são oxidase positiva) das

Enterobacteriaceae (que são oxidase negativa). As Neisseriaceae são também oxidase

positiva.

 Teste Bacitracina

- Amostra: colónias com β-hemólise sugestiva. Usa placas em meio de Columbia. - Fundamento: Streptococcus β-hemolítico do grupo A de Lancefield são geralmente sensíveis a pequena quantidade de Bacitracina. Pelo contrário os Streptococcus β-hemolíticos de outros grupos são geralmente resistentes.

 Teste Optoquina

- Amostra: colónias com α-hemólise. Usa placas em meio de Columbia. - Objetivo: Permite testar a sensibilidade dos Streptococcus à optoquina.

- Fundamento: O Streptococcus pneumoniae é geralmente sensível ao contrário dos outros Streptococcus.

 Teste de grupagem para identificação de Streptococcus β-hemolíticos - Amostra: colónias com β-hemólise.

Os Streptococcus β-hemolíticos possuem antigénios específicos de grupo que podem ser extraídos e identificados com anti-soros. Assim o reagente constituído por partículas de látex sensibilizado por anticorpos dirigidos contra os antigénios, ligam-se aos antigénios correspondentes, formando uma aglutinação visível das partículas de látex. Teste para grupagem dos Streptococcus β-hemolíticos do grupo A, B, C, D, F, G. O resultado positivo verifica-se pela aglutinação em menos de 2 minutos.

 Galeria de identificação de Neisseria, Haemophilus e Branhamella catarrhalis

- Amostra: cultura em gelose de sangue com colónias suspeitas de Branhamella

catarrhalis ou gelose de chocolate com suspeita de Neisseria e Hemophilus.

- Fundamento: O API NH é um sistema padronizado para identificação de Neisseria,

Haemophilus e Branhamella catarrhalis, que engloba mini testes.

 Identificação serológica de E. coli enteropatogénica - Amostra: colónia de E. coli.

- Fundamento: Soro aglutinante anti - E. coli nonavalente.  Identificação de Bactérias anaeróbias

- Amostra: colónias em cultura pura com 24 a 48h de incubação. Caso a cultura não seja pura, fazer um pré-isolamento antes da identificação. Placas em meio de Columbia ou meio de Schaedler.

- Objetivo: Permite a identificação de bactérias anaeróbias e Corynebacterium de relevância clinica.

 Identificação de Cocos Gram positivo

- Amostra: Colónia em cultura pura com 12 a 48h de incubação. Caso a cultura não seja pura, fazer um re-isolamento antes do antibiograma. Retirar uma colónia com a ansa e semeá-la numa placa de Columbia que incuba 18 a 24h (a 35 ± 2 °C).

- Equipamento: VITEK2.

A carta de GP (Gram positivos) destina-se a identificar a maior parte dos Cocos Gram positivo de interesse clinico. Cada carta é constituída por 43 testes bioquímicos que medem a utilização da fonte de carbono, a resistência e atividade enzimática. Cada carta é cheia e selada e colocada no incubador/leitor, automaticamente. O VITEK2 fornece a identificação em cerca de 8h, baseado nas reações químicas e na base de dados do próprio equipamento.

 Identificação de Bacilos Gram negativo

- Amostra: Colónias em cultura pura com 18 a 24h de incubação. Se não for pura fazer re-isolamento antes da identificação. Retirar uma colónia com a ansa e semeá-la numa placa de MacConkey. Incubar a 35 ± 2 °C durante 24h.

O equipamento é o VITE2 e utilizam-se placas com meio de MacConkey, meio de Cled, meio de Columbia.

Cartas GN (Gram negativo) destinam-se a identificação da maioria dos Bacilos Gram negativo fermentadores e não fermentadores. Cada carta baseia-se em métodos bioquímicos estabelecidos e em substratos que medem a utilização das fontes de carbono, atividade enzimática e resistência. Existem 47 testes bioquímicos e um poço de controlo negativo. O poço de controlo negativo para a descarboxilase é usado como referência do valor base para os poços do teste descarboxilase. Os resultados finais estão disponíveis em cerca de 10h, baseados nas reações químicas e na base de dados do próprio sistema.

 Identificação de Leveduras

- Amostra: Colónias em cultura pura com 18 a 24h de incubação, caso a cultura não seja pura, fazer re-isolamento antes do antibiograma. Retirar uma colónia com a ansa e semeá-la numa placa de Sabouraud (com gentamicina e cloranfenicol) e incubá-la 18 a 24h.

As cartas ID-YST destinam-se à identificação da maior parte dos fungos com significado clínico. Cada carta tem 46 testes bioquímicos. Cada carta é cheia, selada e colocada no incubador/leitor automaticamente. O VITEK2 fornece a identificação em cerca de 15 horas.

 Identificação Serológica de Salmonella spp.

- Amostra: Colónias de Salmonella, identificadas bioquimicamente para confirmação serológica.

A espécie Salmonella causa diversas infeções que podem ir desde graves como a febre tifóide até infeções menos graves como as gastroenterites. A sua identificação é feita por testes bioquímicos, mas deve ser sempre confirmada serologicamente com um soro polivalente para as aglutininas somáticas incluindo também o antigénio capsular (vi).

 Identificação de Neisseria, Haemophilus, Campylobacter spp. e Gardnerella vaginalis

- Amostra: Colónias em cultura pura com 18 a 24h de incubação. Caso a cultura não seja pura, fazer um re-isolamento antes da identificação.

Placas em meio de chocolate Haemophylus, Campylosel, chocolate VCAT. - Equipamento: VITEK2

- Carta IDNH: destina-se à identificação de Neisseria spp., Haemophilus spp.,

Campylobacter spp. e Gardnerella vaginalis. Cada carta baseia-se em métodos

bioquímicos com substratos recentemente desenvolvidos. Existem 30 testes bioquímicos. Os resultados estão disponíveis em 6 horas.

Tabela 2: Identificação de bactérias

Gram Catalase _{Steph Plus} Slidex Oxidase Bacitracina Optoquina Grupagem de _{Lancefield Poli A-I e Vi} Serol. Salm. Antiserum E. coli _nonavalente GN GP _{Test Kit} ANC API _NH

Enterobacteriaceae X X Shigella e Salmonella X X E. coli enteropatogénica X X Não fermentadores X X X Bacilos GN de crescimento fastidioso X X X Neisseria e Morexella X X X Haemophylus influenzae X X Staphylococcus spp. X X X X Streptococcus spp. X X X X Streptococcus X X

pneumoniae

Enterococcus spp. X X X X

Campylobacter spp. X X X

Listeria spp. X X X