Encapsulation des composés

I.4.3.1 Etude de l’encapsulation de composés dilués

Jusqu’à présent, dans le cadre des études d’encapsulation de la fluorescéine tout comme pour l’encapsulation de la coumarine A ou de l’alcyne B, nous avions travaillé à des concentrations massiques élevées de produit dans les gouttes (3% w/v), ce qui correspondait à des concentrations molaires dans les gouttes égales respectivement à 90 mM pour la fluorescéine, 88 mM pour la coumarine A et 148 mM pour l’alcyne B. Paradoxalement, l’encapsulation de composés plus dilués (concentrations dans la gamme μM par exemple) s’est avérée problématique. Nous avons alors postulé que lorsqu’un composé était encapsulé à forte concentration (centaine de mM), il participait à la stabilisation de l’émulsion, stabilisation qui faisait alors défaut dans le cas de solutions diluées (μM). Afin d’être en mesure d’encapsuler les composés désirés indépendamment de leur concentration, nous avons de ce fait étudié la stabilité d’émulsions primaires « vides », c’est à dire dont la phase interne aqueuse ne contient aucun composé. Si de telles émulsions s’avéraient stables, nous pourrions a fortiori supposer que des émulsions de composés très dilués de même formulation seraient stables également.

Nous avons tout d’abord cherché à estimer la taille d’une émulsion primaire d’eau pure (eau MilliQ).

On peut voir sur la Figure I.36 qu’à 2% w/v en krytox dans la phase fluorée, non seulement les tailles d’émulsion mesurées par DLS sont très variables (de 300 à presque 1000 nm), mais que visuellement,

94 Stachulski, A. V.; Meng, X. Nat. Prod. Rep. 2013, 30, 806-848.

95 Legigan, T.; Clarhaut, J.; Renoux, B.; Tranoy-Opalinski, I.; Monvoisin, A.; Berjeaud, J.-M.; Guilhot, F.; Papot, S. J. Med.

Chem. 2012, 55, 4516-4520.

71 l’émulsion semble se démixer. Si l’on augmente drastiquement le pourcentage de tensioactif dans la phase fluorée (à 6% w/v), aucune amélioration notable n’est constatée, ni du point de vue de la taille de l’émulsion, ni du point de vue de son aspect visuel.

L’eau pure a alors été remplacée par de l’eau tirée du robinet, et une émulsion entre cette eau et une phase de PFC à 2% w/v en krytox a été préparée : on constate alors une légère amélioration des propriétés de l’émulsion. Sa taille telle que mesurée par la méthode de DLS reste inférieure à 550 nm et l’émulsion semble moins démixée que précédemment. Un tel résultat nous encourage à conclure que c’est la présence d’impuretés dans l’eau du robinet (ions, molécules diverses, etc…) par rapport à l’eau pure qui permet d’améliorer la stabilité de l’émulsion primaire correspondante. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons encapsulé diverses solutions aqueuses tamponnées, et donc chargées en ions, comme le TRIS base (Tris(hydroxymethyl)aminométhane), le MOPS (acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique) et le PBS (tampon phosphate salin couramment utilisé en biologie contenant du chlorure de sodium, du phosphate disodique, du phosphate monopotassique, ainsi qu’un peu de chlorure de potassium). Dans ces trois cas, l’aspect visuel de l’émulsion est homogène, et par conséquent très satisfaisant. Quant aux tailles mesurées par la méthode de DLS, elles s’échelonnent entre 150 et 400 nm environ, ce qui est également l’objectif poursuivi.

Figure I.36. Mesure par DLS de la taille de différentes émulsions primaires, et aspect visuel des émulsions étudiées.

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Finalement, il semble que l’utilisation des solutions salines de différentes nature mentionnées précedemment (TRIS, MOPS, PBS) permette d’obtenir des émulsions primaires « vides » de bonne qualité.

A partir de l’étude précédente, nous avons alors opté pour une solution saline de PBS 10X (concentration commerciale) ou de PBS 1X (solution commerciale diluée 10 fois) comme base de dilution pour nos composés d’intérêt. Nous avons étudié les caractéristiques en termes de taille de différentes émulsions de PBS, en faisant varier le pourcentage de krytox dans la phase fluorée de 2% à 3.5% (Figure I.37).

Nous avons constaté peu de différences entre ces différentes émulsions : leur taille restait comprise entre 50 nm et 400 nm et surtout restait stable (même gamme de valeurs, de 100 nm à 400 nm) après 24 h. Un tel résultat est encourageant dans la perspective de pouvoir encapsuler des produits dilués au μM ou de concentrations encore inférieures, puisque la concentration en krytox pourra être ajustée en fonction du composé encapsulé afin d’obtenir une stabilité maximale.

Figure I.37. Evolution de la taille d’émulsions primaires de PBS1X en fonction du pourcentage de krytox dans la phase fluorée (à t=0 et t=24h).

I.4.3.2 Encapsulation des composés actifs

Les composés à encapsuler pour l’étude in vitro (HMR1826, doxorubicine, MMAE-glu, MMAE) ont été dissous dans une solution de PBS 1X filtrée à 0.2 μm, conformément aux résultats obtenus précédemment sur l’encapsulation de produits dilués. Les concentrations des solutions mères ainsi obtenues valaient respectivement 4.5 mM pour le HMR1826 et la DOX, et 1 mM pour la MMAE-glu et la MMAE. Pour ces dernières, des dilutions à 0.5 mM (« MMAE/MMAE-glu 5X ») ou à 0.1 mM (« MMAE/MMAE-glu 1X ») ont également été réalisées. Les émulsions primaires entre ces solutions salines et le perfluorohexane ont ensuite été obtenues selon le protocole de sonication déjà décrit au paragraphe I.2.4.2.

73 Nous avions mené l’étude de preuve de concept de chimie in situ en utilisant le sel d’ammonium du Krytox comme tensioactif pour stabiliser les émulsions primaires encapsulées dans les microgouttes.

Cependant, pour l’étude in vitro, l’utilisation d’un nouveau tensioactif a été envisagée. En effet, le sel d’ammonium présentait plusieurs inconvénients. Tout d’abord, l’étude de biodistribution menée par nos collaborateurs de l’Institut Langevin a montré que ce tensioactif provoquait de graves inflammations pulmonaires sur les souris traitées par les microgouttes de PFC, probablement du fait d’une intoxication à l’ammoniac liée à la structure même du tensioactif. Dans la perspective d’utiliser à terme des microgouttes pour traiter des tumeurs, il était donc nécessaire de trouver une alternative au sel d’ammonium du Krytox. Notre choix s’est très vite porté sur un copolymère non ionique de structure Krytox-PEG-Krytox (« PEG-di-Krytox »). La biocompatibilité de ce tensioactif ainsi que sa capacité à stabiliser des émulsions d’eau dans le perfluorocarbone ont été établies par Holtze et al.⁹⁶ Ainsi, si l’on compare le vieillissement de deux émulsions primaires de HMR1826 dans le PFC stabilisées respectivement par le sel d’ammonium du Krytox ou par le PEG-di-Krytox commercial (Schéma I.20), on constate une nette différence de stabilité (Figure I.38).

Schéma I.20. Structure du tensioactif PEG-di-Krytox dérivé du Krytox commercial.

On note en particulier une densification de l’émulsion stabilisée par le K-NH4+ (Figure I.38, 1) ainsi que l’apparition d’une zone plus colorée et non fluide (Figure I.38, 2). Enfin, du PFC incolore et démixé du reste de l’émulsion apparaît sous l’émulsion (Figure I.38, 3) alors que l’émulsion stabilisée par le PEG-di-Krytox présente un aspect homogène même après 72 h.

96 Holtze, C.; Rowat, A. C.; Agresti, J. J.; Hutchison, J. B.; Angilè, F. E.; Schmitz, C. H. J.; Köster, S.; Duan, H.; Humphry, K.

J.; Scanga, R. A.; Johnson, J. S.; Pisignano, D.; Weitz, D. A. Lab Chip 2008, 8, 1632-1639.

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Figure I.38. Evolution à +72 h de deux émulsions de HMR1826 dans le PFC, stabilisées respectivement par le sel d’ammonium du Krytox (K-NH4+) ou par le copolymère de Krytox (PEG-di-Krytox).

Finalement, si nous avons majoritairement utilisé le PEG-di-Krytox pour l’encapsulation et le largage ultrasonore de la MMAE, certaines expériences préliminaires avec le HMR1826 ont été réalisées avec des émulsions stabilisées par le K-NH4+. La nature du tensioactif fluoré utilisé sera donc précisée pour chaque série d’expériences.

Les microgouttes de PFC utilisées pour l’étude in vitro sont produites à partir des émulsions primaires stabilisées par l’un ou l’autre des tensioactifs fluorés. Le système microfluidique parallélisé décrit précédemment nous a permis de produire jusqu’à 50 μL de gouttes par heure. Après la production des gouttes, le surnageant composé d’une solution de PBS 1X + 3% w/v de Pluronic-F68 a été remplacé par une nouvelle solution de PBS 1X contenant non seulement le tensioactif mais également des antibiotiques (pluronic-F68 3% w/v, pénicilline/streptomycine 2X, gentamycine 2X, kanamycine 2X) afin de prévenir tout développement bactérien. Ces microgouttes sont ensuite stockées à 4 °C pendant 48 h avant d’être mises en suspension dans du milieu de culture et avant utilisation.

I.4.4 Conditions expérimentales