4.5.3.(1) Expériences en transfert

La monométhylauristatin E (MMAE) étant une drogue environ 1000 fois plus toxique que la doxorubicine, une concentration trop élevée dans les gouttes mène à une mortalité totale des populations cellulaires mises en contact avec ces gouttes. En effet, même une très faible fuite du produit hors des gouttes suffit à induire, avec ou sans largage, une prolifération cellulaire proche de zéro. En particulier, on observe sur la Figure I.47 que pour une concentration en MMAE-glu intra-gouttes de 0.5 mM (notée MMAE-glu 5X), et une exposition systématique à la β-glucuronidase, toutes les suspensions de microgouttes étudiées (concentrations en gouttes entre 1% et 0.005%) conduisent à une prolifération cellulaire très faible, comprise entre 11% et 33%, avec ou sans largage ultrasonore. Néanmoins, à partir de 0.025% de gouttes en suspension, il semble que le largage ultrasonore induise une surmortalité par rapport au cas de non-largage. Cette différence est cependant trop faible pour être exploitable dans le cadre de la chimie in situ.

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Figure I.47. Effet sur la prolifération de cellules KB de suspensions à différentes concentrations (v/v) de gouttes de MMAE-glu 5X (concentration d’encapsulation = 0.5 mM) avec/sans largage et après transfert du surnageant

et incubation en présence de β-glucuronidase.

Bien que les résultats en présence d’enzyme montrent que cette concentration d’encapsulation en MMAE-glu est trop élevée, il est tout de même intéressant d’étudier ces mêmes gouttes en l’absence de β-glucuronidase, avec ou sans largage ultrasonore. Les résultats obtenus dans ces conditions sont rassemblés dans la Figure I.48. Nous avons vu que la MMAE-glu avait une toxicité environ 100 fois moindre par rapport à la MMAE. Cependant, cette dernière étant particulièrement active, des suspensions concentrées en pro-drogue induisent tout de même une mortalité non négligeable (seulement 21% à 72% de prolifération cellulaire pour les suspensions de concentrations supérieures à 0.05%). Il faut noter que malgré tout, dans ces derniers cas, le largage par ultrasons engendre une surmortalité par rapport aux fuites seules. A plus faible concentration en gouttes, la prolifération cellulaire redevient normale (88% à 96%), avec ou sans largage ultrasonore.

Figure I.48. Effet sur la prolifération de cellules KB de suspensions à différentes concentrations (v/v) de gouttes de MMAE-glu 5X (concentration d’encapsulation = 0.5 mM) avec/sans largage et après transfert du surnageant

et incubation.

83 Suite à ces résultats, l’étude n’a pas été poursuivie avec les gouttes de MMAE-glu 5X, ces dernières s’étant révélées trop concentrées pour évaluer l’effet du largage sur la prolifération cellulaire de la lignée KB. La concentration intra-gouttes a ainsi été réduite à 0.1 mM (MMAE-glu 1X). Nous avons tout d’abord étudié la prolifération cellulaire en présence d’enzyme, avec ou sans largage ultrasonore.

Comme précédemment, nous avons testé une gamme de suspensions de gouttes allant de 1% v/v à 0.005% v/v (Figure I.49). Dans chaque cas, nous avons comparé l’effet du largage avec celui des fuites.

Comme pour la MMAE-glu 5X, les suspensions les plus concentrées (1% à 0.025%) donnent peu de différences entre les deux cas (+/- ultrasons). La suspension à 0.01% en gouttes semble la plus prometteuse. En effet, en l’absence de largage ultrasonore, la prolifération cellulaire en présence d’enzyme atteint 85% de la référence « non traitée ». L’exposition à 4 pulses ultrasonores mène à une chute de la prolifération à 44%. C’est la seule suspension pour laquelle on observe une telle différence entre ces deux conditions. Enfin, la suspension à 0.005% en gouttes semble trop diluée pour induire une mortalité cellulaire conséquente (87% de prolifération sans largage et 75% avec largage).

Figure I.49. Effet sur la prolifération de cellules KB de suspensions à différentes concentrations (v/v) de gouttes de MMAE-glu 1X (concentration d’encapsulation = 0.1 mM) avec/sans largage et après transfert du surnageant

et incubation en présence de β-glucuronidase.

En l’absence de β-glucuronidase, on obtient pour la MMAE-glu 1X les résultats de prolifération cellulaire présentés dans la Figure I.50. Ainsi, pour des concentrations inférieures à 0.1% en gouttes, la prolifération cellulaire n’est plus affectée par la présence des gouttes, avec ou sans largage. A 0.25% en gouttes, la prolifération est normale en l’absence de largage ultrasonore (97%). En cas de largage, elle chute légèrement à 91% en moyenne. Dans le cas de l’utilisation de fortes concentrations en gouttes (1% et 0.5%), la prolifération décroît entre 52% et 76% de sa valeur de référence.

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Figure I.50. Effet sur la prolifération de cellules KB de suspensions à différentes concentrations (v/v) de gouttes de MMAE-glu 1X (concentration d’encapsulation = 0.1 mM) avec/sans largage et après transfert du surnageant

et incubation.

Si on compare les résultats obtenus avec la MMAE-glu 1X avec des expériences similaires sur des gouttes de MMAE 1X, on obtient les valeurs de prolifération cellulaires présentées Figure I.51. Pour des suspensions à 0.025% et plus concentrées, on observe une mortalité presque totale des cultures cellulaires. A partir, de 0.01% de gouttes dans le milieu de culture, on restaure une prolifération cellulaire presque normale (68% à 87% de prolifération selon les conditions).

Figure I.51. Effet sur la prolifération de cellules KB de suspensions à différentes concentrations (v/v) de gouttes de MMAE 1X (concentration d’encapsulation = 0.1 mM) avec/sans largage et après transfert du surnageant et

incubation.

A la suite de cette étude, il semble donc que les suspensions à 0.01% v/v de gouttes de MMAE et de MMAE-glu dans le milieu de culture donnent les meilleurs résultats. Ces derniers sont résumés sur la Figure I.52. On obtient finalement un gain de 48% de la mortalité cellulaire en cas de largage de la pro-drogue par ultrasons en présence d’enzyme par rapport à la quantité de produit activé par l’enzyme en cas de fuite « passive » hors des microgouttes.

85 Figure I.52. Bilan des résultats obtenus en termes de prolifération des cellules KB pour des suspensions de

gouttes de MMAE et MMAE-glu 1X à 0.01% (concentration d’encapsulation = 0.1 mM).

Nous avons ainsi pu montrer qu’il était possible d’initier in vitro la conversion locale de la MMAE-glu en sa forme active, la MMAE, par largage ultrasonore localisé et spécifiquement en présence de la β-glucuronidase. En l’absence de cette dernière, la prolifération cellulaire n’est pas affectée par le largage de la MMAE-glu, celle-ci étant significativement moins toxique que sa forme activée.