Figure 15. : Schéma représentatif des différentes configurations utilisées en patch-clamp, d’après Hamill et al., (1981) : L’électrode de mesure, placée à l’intérieur de la pipette de patch est reliée au
headstage contenant un convertisseur courant / tension permettant de mesurer les courants générés par
Matériel et Méthodes
39
seulement physiquement mais également d’un point de vue électrique : l’obtention d’un scellement de 10 à 20 gigaOhms (GΩ, gigaseal), permet de mesurer les courants de faible amplitude (de l’ordre du picoampère, pA), induits par le passage d’ions à l’intérieur du pore de conduction qui constitue le canal. De la qualité du scellement dépend la qualité de l’enregistrement. En effet, le scellement conditionne non seulement la qualité de l’isolation électrique du patch mais également la stabilité mécanique du scellement, ainsi que la compartimentation de la préparation.
L’obtention d’un gigaseal permet différentes approches expérimentales selon quatre configurations membranaires différentes. La membrane forme alors une barrière de diffusion élevée qui isole deux compartiments distincts de compositions ioniques et chimiques différentes.
La configuration initiale du patch-clamp appelée cell-attached (Fig. 15), est obtenue immédiatement après la formation du scellement. Pour la portion de membrane isolée, le milieu extracellulaire se trouve donc être le milieu de remplissage de la pipette. En revanche, le milieu intracellulaire reste quant à lui inchangé. L’intégrité de la cellule étant préservée, les courants ioniques ainsi enregistrés sont obtenus dans des conditions relativement physiologiques. Cette configuration permet notamment de connaître les fréquences d’ouverture des canaux au potentiel spontané de repos de la membrane, c’est-à-dire lorsque aucun potentiel n’est imposé à la cellule. Toutefois, des dépolarisations ou des hyperpolarisations peuvent être appliquées à la cellule. Le potentiel de membrane de la cellule Vm (en mV) est dans cette configuration défini par l’équation (1) :
p m
m
E V
V = −
(1)Où, Em est le potentiel de membrane spontané de la cellule, et Vp est le potentiel appliqué à la pipette, (tous deux sont exprimés en mV).
Cependant, cette configuration n’offre pas la possibilité de tester l’effet de modulateurs au niveau de la face cytoplasmique ou extracellulaire du canal pour en étudier le
Matériel et Méthodes
40
fonctionnement. Aussi, après formation du scellement, la pipette peut être rapidement sortie et replongée dans la solution de bain, ainsi, la cellule éclate, seul reste le patch présent à l’extrémité de la pipette. Dès lors, la face cytosolique du canal est accessible, permettant ainsi l’emploi d’agonistes ayant un mode d’action intracellulaire. Dans cette configuration excisée ou inside-out (Fig. 15) la valeur du potentiel de membrane Vm est uniquement fonction de la valeur du potentiel imposé à la pipette (Vp mesuré en mV) et est égale à :
p
m
V
V =−
(2)La configuration whole-cell (Fig. 15) est également obtenue à partir de la configuration
cell-attached, lorsqu’une forte aspiration est pratiquée à l’intérieur de la microélectrode, ou quand un zap est appliqué, c’est-à-dire une impulsion électrique d’un volt pendant un laps de temps de l’ordre de la milliseconde (sa durée est définie par l’expérimentateur). Le milieu cytoplasmique se trouve ainsi « dilué » par la solution remplissant la microélectrode, le contenu intracellulaire est alors entièrement contrôlé. Dans ce cas, il est possible d’observer l’activité électrique résultant du fonctionnement de la totalité des canaux actifs présents dans la membrane plasmique. Le potentiel de membrane Vm est alors égal au potentiel appliqué à la pipette (Vp) :
p
m
V
V =+
(3)A partir de cette configuration, une seconde configuration excisée peut être obtenue en procédant de la même façon que pour passer en inside-out. Cette dernière configuration du
patch-clamp est appelée outside-out. Seul, le fragment membranaire situé autour de la pipette résiste à l’éclatement cellulaire lorsque la cellule est sortie hors de la solution de bain. La face externe de ce fragment de membrane se « reconstitue » dès qu’il se retrouve en contact avec la solution de bain. Cette dernière configuration n’a pas été utilisée lors de cette étude.
Figure 16. : Anatomie du poste de patch-clamp : 1 : Optique - Microscope inversé : Nikon Diaphot 300 1' : Variateur d’intensité de l'éclairage
2 : Caméra reliée au moniteur TV 2' : Alimentation extérieure de la caméra
3 : Table antivibration : isolation de tout mouvement extérieur 3' : Bouteille d'azote: gaz utilisé pour la suspension de la table
4 : Cage de Faraday : isolation de tout rayonnement électromagnétique extérieur 5 : Tête de mesure (Headstage) : conversion courant/tension, amplification du signal 6 : Macromanipulateur
7 : Micromanipulateur
Matériel et Méthodes
41
4.2. Enregistrement des courants et anatomie du poste de patch-clamp :
Les pipettes de patch sont étirées à partir de capillaires en borosilicate (GC 150F-10, Clarck Electromedical Instrument) d’un diamètre externe de 1.5 mm et d’un diamètre interne de 0.86 mm, à l’aide d’une étireuse horizontale programmable (DMZ puller, Werner Zeitz, Augsbourg, Allemagne). Après rodage, les pipettes sont remplies de Ringer NMDG. Comme son nom l’indique cette solution contient du NMDG ou N-méthyl-D-glucamine (SIGMA), qui est un cation imperméant. L’utilisation de cette solution permet de s’affranchir au cours de l’enregistrement des courants cationiques. La résistance de ces pipettes plongées dans du Ringer NaCl (Tab. 3) est de 8 à 20 MOhms (MΩ). La réalisation du scellement, dans cette solution de Ringer NaCl15, s’effectue par succion (une dépression de 30 mbar, calibrée grâce à un vacuomètre, est appliquée à l’intérieur de la pipette, dès que cette dernière entre en contact avec la membrane cellulaire), sous un double contrôle optique (grâce à la camera qui relie le microscope du poste de patch à un moniteur, Fig. 16) et électrique. Des impulsions électriques carrées (pulses) de 10 mV sont imposées lors du scellement afin de contrôler l’évolution de la résistance du système pipette/membrane jusqu’à l’obtention du
gigaseal. Simultanément, un potentiel négatif de 30 mV est imposé à la membrane durant la formation du seal. Les scellements ainsi réalisés présentent une résistance de l’ordre de 10 à 20 GΩ. Le potentiel imposé à la pipette (Vp) se réfère à la masse constituée par une électrode de référence située dans le bain (Fig. 15). Cette électrode de référence est constituée d’une électrode Ag/AgCl et d’un pont d’Agar (Agar à 3% dans du KCl 1M). Une fois le scellement obtenu, la solution de bain (Ringer NaCl) est remplacée par une solution de Ringer NMDG, afin de réaliser les enregistrements en présence de concentrations ioniques symétriques pour les ions chlorure.
15 Les cations divalents (calcium et magnésium) qu’il contient peuvent former des liaisons, sous forme de ponts salins, avec les charges négatives du verre et la surface membranaire. Ces interactions favorisent et facilitent l’obtention d’un seal de bonne qualité.