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ta
n
c
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e
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tra
n
te
Concentration de l’inhibiteur (-log [x], µM)
6 3
9
50
Figure 10. : Etude, en configuration whole-cell, de l’effet d’inhibiteurs de canaux chlorure sur la conductance membranaire globale de globules rouges induite lors de l'infection par Plasmodium
falciparum :
Calculs de l’IC50 du NPPB (0.8 ± 0.3 µM, n = 4), de l’acide niflumique (2.5 ± 0.3 µM, n = 4), et de la glibenclamide (35.0 ± 8.7 µM, n = 3) à partir de la conductance entrante mesurée sur des cellules infectées par Plasmodium falciparum.
Introduction
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- Plasmodium falciparum infecterait certaines sous-populations de cellules (telles que les réticulocytes et les jeunes érythrocytes) dont les transporteurs présentent un plus haut degré d’activité ;
- Ou encore le parasite serait capable d’induire une augmentation du nombre de transporteurs natifs.
Toutefois, cette dernière hypothèse semble la moins probable étant donné l’absence totale de machinerie nécessaire à la synthèse et à l’adressage de nouvelles protéines à l’intérieur de la cellule hôte.
Les données accumulées grâce aux mesures de flux isotopiques indiquent que le NPP possède les caractéristiques fonctionnelles d’un canal ionique. Or, trois études électrophysiologiques (Desai et al., 2000; Huber et al., 2002b; Egee et al., 2002, Annexe I) démontrent que les globules rouges infectés présentent une conductance fortement supérieure à celle des hématies non infectées. Ainsi, avons nous pu établir, tout comme les équipes de Sanjay Desai et de Stephan Huber, que les érythrocytes infectés par
Plasmodium falciparum présentent une forte conductance membranaire entrante
spontanément active (5300 ± 140 pS). La séquence de sélectivité que nous avons déterminée par substitution en conditions bi-ioniques donne une séquence d’Eisenmann I (Wright et Diamond, 1977) : I- >Br- >Cl-. De plus, le NPPB, l’acide niflumique et la glibenclamide, trois inhibiteurs de canaux chlorure ont été testés afin de déterminer leur IC5011 (Fig. 10). Les valeurs obtenues respectivement : 0.8 ± 0.3 µM (n = 4); 2.5 ± 0.3 µM (n = 4) et 35.0 ± 8.7 µM (n = 3), sont du même ordre de grandeur que celles obtenues par des mesures de flux isotopiques ou de lyse isosmotique (Tab. 2 A, Kirk et Horner, 1995a). Le furosémide (200 µM), connu comme étant un puissant inhibiteur12 des transporteurs de solutés induits par Plasmodium falciparum s’est révélé moins efficace que les trois autres inhibiteurs testés, puisqu’il ne réduit que de 45% les courants mesurés. Les enregistrements
11 Concentration pour laquelle les courants entrants sont réduits de moitié.
A
Vm= +100 mV -100 mV +80 mV -80 mV +60 mV -60 mV+40 mV
-40 mV
500 ms
5 pA
-2
8
-100
I, pA
V
m, mV
100
2
4
6
-50
50
B
Figure 11. : Caractérisation, en configuration inside-out, du canal anionique rectifié sortant, spontanément actif dans la membrane de globules rouges non infectés:
A : Enregistrements caractéristiques de l’activité du canal pour différents potentiels de membrane (Vm). (La ligne continue indique l’état fermé du canal).
B : Relation courant-voltage correspondante. Les valeurs du courant (I) sont la moyenne ± SEM (erreur standard à la moyenne) de 10 enregistrements.
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unitaires réalisés en configuration excisée (inside-out) montrent des canaux spontanément actifs de 12 pS de conductance linéaire. De tels résultats conjointement à ceux obtenus par les équipes de Sanjay Desai et de Stephan Huber, nous permettent de supposer que ces canaux sont en partie responsables de l’augmentation des échanges membranaires observés au cours du développement parasitaire de Plasmodium.
Contrairement aux érythrocytes infectés, la conductance membranaire globale des cellules non infectées est négligeable du fait du faible nombre de canaux anioniques naturellement actifs, et ce quelque soit la configuration de la technique du patch-clamp utilisée. Ainsi, la conductance membranaire globale des érythrocytes, mesurée en
whole-cell, est faible (environ 45 pS), ce qui est en accord avec la valeur calculée par Bennekou (1999). Pourtant, à l'inverse de Desai et collaborateurs, il nous a été possible d’observer deux types de canaux chlorure dans la membrane des érythrocytes non infectés.
Le premier, rare, rectifié sortant a pu être observé dans moins de 5% des cellules étudiées en configuration excisée. Ce canal, spontanément actif, présente une conductance entrante d’environ 11 pS (mesurée entre -100 et 0 mV) et une conductance sortante d’environ 80 pS aux potentiels de membrane positifs (Fig. 11). L’application d’inhibiteurs de canaux chlorure, au niveau de la face cytosolique du canal, tels que le NPPB (100 µM, n= 4), DIDS (100 µM, n= 4) et le 9-AC (100 µM, n= 3), entraîne une inhibition totale de l’activité du canal en quelques secondes. Ces caractéristiques nous permettent de supposer que ce canal appartient à la famille des canaux ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channels). Ce canal, comme nous le verrons dans le chapitre 3, pourrait expliquer la forte conductance rectifiée sortante, observée par Huber et collaborateurs, sur de nombreuses cellules infectées (Huber et al., 2002b).
Le second canal, plus fréquent, a pu être observé lorsqu’une déformation membranaire est appliquée par l’intermédiaire d’une dépression calibrée à l’intérieur de la pipette de patch ou en présence de la sous-unité catalytique de la protéine kinase A de bœuf (PKAc, 100 nM) et d’ATP (1 mM) au niveau de la face cytosolique de la membrane. En revanche l’ATP seul se
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révèle sans effet sur les courants membranaires mesurés en configuration whole-cell et ne permet pas l’activation de canaux ioniques en configuration excisée. En whole-cell, les courants mesurés en présence de PKAc et d’ATP dans la pipette sont multipliés par 40 par rapport à ceux de cellules non stimulées (la conductance membranaire passe en effet de 44 ± 1 pS à 1700 ± 40 pS) et présentent une rectification entrante. Cette conductance membranaire, bien que 2.5 à 3 fois plus faible que celle des globules rouges infectés (notons que l’ajout de PKAc et d’ATP n’a pas d’effet sur les courants membranaires de ces cellules), présente la même séquence de sélectivité de type Eisenmann I. De plus, elle possède le même profil pharmacologique que celui des cellules infectées. Les enregistrements unitaires réalisés en inside-out dans les mêmes conditions, permettent d’observer une conductance linéaire de 12 pS proche de celle mesurée sur des cellules infectées, toutefois, contrairement à ces dernières, un lent run-down apparaît 5 minutes après activation par la PKAc.
L’étude des canaux observés dans la membrane des cellules intactes et infectées présente un intérêt double. D’une part, les cellules non infectées possèdent des canaux anioniques de faible conductance, mécano-sensibles et activés par la sous-unité catalytique de la PKA. Ces caractéristiques ne sont pas sans rappeler l’activité de type CFTR détaillée par Sprague (Sprague et al., 1998; Sprague et al., 2001) dans la membrane de globules rouges humains. En effet, cette activité peut être induite lorsque les hématies sont soumises à un stress mécanique ou par l’intermédiaire d’une voie AMPc dépendante. Or, cette dernière constitue une condition sine qua none pour permettre l’activation des canaux CFTR présents au niveau de la face apicale de cellules épithéliales (Sheppard et Welsh, 1999). D’autre part, ces canaux sont fortement similaires à ceux observés chez les cellules infectées. Ceci, conjointement aux travaux de Huber et al., (2002b) et de Thomas et al., (2001) sur
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endogène de l’accroissement du flux de solutés de faible poids moléculaire à travers la membrane plasmique d’un érythrocyte infecté.
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Le présent mémoire a pour double objectif de déterminer tout d’abord l’identité des canaux de faible conductance présents dans la membrane des globules rouges non infectés : ces canaux peuvent-ils être qualifiés de CFTR-like13 ? Pour tenter de répondre à cette question, une comparaison systématique du comportement et des caractéristiques électrophysiologiques du canal chlore de 12 pS de conductance a été effectuée sur deux types de globules rouges. Les premiers servant de contrôles positifs proviennent de donneurs en bonne santé, les seconds proviennent de patients volontaires atteints de mucoviscidose (Quinton, 1999), porteurs de la mutation ∆F508. Le choix de ce type de cellules est motivé par le fait que cette mutation entraîne la synthèse d’une protéine « anormale » qui n’est plus correctement exportée, ce qui en diminue la quantité présente dans la membrane cellulaire. Si de tels canaux sont présents dans la membrane des globules rouges, leur rôle physiologique reste encore indéterminé.
Le second objectif de cette étude est de consolider l’hypothèse selon laquelle le NPP n’est pas une xénoprotéine de transport exprimée par Plasmodium falciparum et exportée dans la membrane de la cellule hôte, mais bien un transporteur endogène propre à cette dernière. Nous tenterons également d’appréhender les mécanismes mis en œuvre par le parasite pour en contrôler l’activité.
13 Le terme CFTR est strictement réservé pour désigner les canaux présents dans la membrane de cellules épithéliales.