2.3- Elaboration du biofilm bactérien

Toutes les manipulations ont été réalisées en milieu stérile près d‘une flamme de bec bunsen et l‘ensemble du matériel utilisé fut autoclaver pendant 15 min à 121°C.

Pour la réalisation de la suspension bactérienne, le milieu nutritif utilisé est le LB de concentration massique 25 g/l. Deux types de cultures ont été préparés pour l‘élaboration du biofilm : La première dite pré-culture, elle a été préparée en mélangeant 0,5 g de LB dans 20 ml d‘eau Milli-Q, la seconde est le milieu de culture LB a été préparé en mélangeant 5 g de

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LB avec 200 ml d‘eau Milli-Q. Ainsi une préparation d‘eau physiologique (0.9% NaCl : 1.8 g de Nacl dans 200 ml d‘eau Milli-Q) et des blancs (références pour la mesure de DO) de LB et de l‘eau physiologique est ainsi exigée.

Une colonie bactérienne est inoculée dans 20 mL de la pré-culture de LB stérile avec des antibiotiques (20 µL d'ampiciline à 100 mg/mL et 40 µL de Kanamycine à 25 mg/mL) dans un erlenmeyer de 100 mL. L‘utilisation de ces antibiotiques est intéressante du fait que la souche utilisée présente une résistance spécifique à ces antibiotiques. La pré-culture est ensuite incubée dans un bain-marie pendant 16 h à 37ºC +/- 1ºC sous agitation (160 rpm). Après 16 h de croissance, une quantité nécessaire de la pré-culture est ajoutée dans 200 mL de LB stérile dans un erlenmeyer de 500 ml afin d'obtenir une DO₆₀₀ initiale de 0,05 +/- 0,01. La culture est ensuite incubée à 37°C sous agitation (160 rpm) dans un bain-marie pendant environ 2 h. L'erlenmeyer contenant la culture bactérienne est enlevé du bain-marie lorsque le DO600 atteint une valeur entre 0,5 et 0,6 (en général après environ 2 h de croissance). La culture est transférée alors dans un tube à centrifuger de 250 ml. Un autre tube de même masse est nécessaire. La culture est centrifugée pendant 10 minutes, à 5000 g et 4°C. Le surnageant est délicatement éliminé dans une poubelle, et le culot est remis en suspension et homogénéisé à l‘aide 10 ml d‘eau physiologique (0,9% de NaCl) en l‘agitant très bien jusqu‘au que la suspension bactérienne disparaisse sans former des agrégats. Ensuite le tout a été versé dans 200 ml d‘eau physiologique et une nouvelle DO a été pris qui devrait être 0.5

+/- 0.02. L‘eau physiologique est utilisée pour transférer les bactéries et le changement de

milieu est important pour éviter aucune influence sur l‘adhésion bactérienne. Cette suspension sera utilisée pour l'élaboration du biofilm.

L‘étape suivante fut de mettre 2 ml de la dernière suspension sur nos surfaces de mica préparées et qui sont déjà placées dans des plaques à 6 puits. L‘ensemble a été mis dans une étuve à 37°C pendant 3 h. Toutefois, et dans le cas où on est obligé à laisser les surfaces dans l‘étuve plus de 3 h (par exemple une nuit complète) et pour éviter que les bactéries ne soient tuées, on doit ajouter aux surfaces (avent de mettre les 2 ml de suspension) 40 µL d‘une solution du sucre (solution de glucose à 20%). Dans notre cas, on les laisse pour environ 24 h.

II.3- Coloration des bactéries : Marquage au backlight

LIVE/DEAD Back Light est une méhode développée par Molecular Probes qui permet de différencier et de dénombrer les cellules viables et mortes. Le principe est basé sur une double coloration par l‘intermédiaire de deux fluorophores : Syto9 et l‘iodure de propidium (PI). SYTO9 cible les acides nucléiques, mais il est capable de traverser la membrane

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cellulaire des cellules mortes et vivantes [354]. Il colore donc, en vert, la totalité des cellules d‘un échantillon. Le PI est un agent intercalant de l‘ADN, une fois lié à ce dernier, le PI émet une fluorescence rouge (ou orange). Ce fluorochrome ne peut pénétrer dans les cellules que si les membranes sont altérées, donc seules les cellules mortes ou endommagées sont colorées en rouge (ou orange).

Toutes nos manipulations du marquage au backlight furent réalisées en conditions stériles sous une PSM (poste de sécurité microbiologique) en salle grise. L‘humidité des surfaces de mica avant de mettre le marqueur est une condition importante pour éviter d‘endommager les membranes des bactéries ainsi le travail doit être à l‘abri puisque le backlight est un marqueur très sensible à la lumière. Avant le marquage des bactéries E.coli par 100 µL de backlight par surface humide, on effectue un double rinçage avec de l‘eau Milli-Q autoclavée stérile puis avec du PBS stérile chacune pour 5 s. La durée du marquage est de l‘ordre de 20 min. Ensuite les surfaces marquées ont été rincés avec de l‘eau stérile (2 ml). L‘étape qui a suivi, fut de bien sécher les surfaces, ensuite de les poser sur une lame de verre. Les photographies furent réalisées au microscope à épifluoresence (objectif*100).

II.4- Estimation du taux de recouvrement et de la taille des bactéries

Les taux de recouvrement et de la taille bactérienne furent déterminés par le logiciel Analy SIS. Les photographies des cultures bactérienne furent modifiées (luminosité et contraste) avec le programme Microsoft Office Picture Manager. Le pourcentage de recouvrement fut calculé en déterminant le pourcentage d‘occupation de la photographie par les bactéries. Le pourcentage de recouvrement et la taille bactérienne pour chaque condition fut obtenu en calculant la moyenne des taux de recouvrement de 10 photographies, le même pour la taille. Les résultats sont présentés sous la forme d‘une moyenne ± l‘erreur standard à la moyenne.

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III- Résultats et discussions

III.1- Caractérisation de surface

Avant de commencer la culture bactérienne et étudier l‘impact des surfaces modifiées sur l‘assemblage des bactéries E.coli, une caractérisation physico-chimique était nécessaire. Cette caractérisation était la même effectuée sur les surfaces utilisées pour l‘étude de développement des CSMs issues de MO dont les résultats sont mentionnés dans la partie III.1 des résultats et discussions du chapitre 2.

Des mesure des angles de contact avec l‘eau des surfaces de silicium silanisées et greffées avec la fibronectine ou le peptide RGD cyclique ont été effectuées, dans le but d‘affirmer rapidement du succès de la modification de nos surfaces, de préciser le profil de polarité de l'échantillon et de vérifier l'hydrophilicité relative des surfaces. Par la technique XRR, nous avons déterminé que la silanisation en phase gazeuse pour le greffage d'une monocouche du 10 - (carboxyméthoxy) décyldiméthylchlorosilane a été mis en place. La technique XPS nous permet de confirmer la silanisation sur nos surfaces, et montrer le greffage de FN et de RGD cyclique sur les monocouches. L‘AFM est utilisée pour examiner la morphologie, l'homogénéité et la topographie des surfaces.

III.2- Etude biologique

Le nombre de surfaces utilisables pour la culture bactérienne était limité.