Effets de structure, effets d’autorité

visceral canina

Os resultados também indicaram que há uma correlação positiva entre o número de sinais clínicos e os níveis de expressão de RNAm de TLR2 (Figura 9A) e TLR4 (Figura 9B) no tecido hepático. Em contraste, a análise de correlação mostrou que a expressão de IL-12 (Figura 9C), IFN-γ (Figura 9D) e iNOS (Figura 9E) foram negativamente associadas ao número de sinais clínicos. A análise da correlação entre os demais TLRs (1, 3, 5, 6, 7, 8, 9), NLRs e citocinas com o número de sinais clínicos, e entre estes marcadores avaliados, não demonstrou resultados estatisticamente significantes.

0 2 4 6 8 10 0

10 20 30

Número de sinais clínicos

E x p re s s ão d e R N A m d e T L R 4 (n o rm a li z a d o p a ra G A P D H ) r=0,4971 P=0,0007 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15

Número de sinais clínicos

E x p re s s ão d e R N A m d e i N O S (n o rm a li z a d o p a ra G A P D H ) r=-0,6661 P<0,0001 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 25

Número de sinais clínicos

E x p re s s ão d e R N A m d e T L R 2 (n o rm a li z a d o p a ra G A P D H ) r=0,4588 P=0,0017

A

B

C

0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 r=0,5931 P=0,001

Número de sinais clínicos

E x p re s s ão d e R N A m d e I F N g (n o rm a li z a d o p a ra G A P D H ) 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30

Número de sinais clínicos

E x p re s s ão d e R N A m d e I L -1 2 (n o rm a li z a d o p a ra G A P D H ) _r=-0,3518 P=0,0122

D

E

Figura 9 - A forma sintomática da leishmaniose visceral canina está correlacionada a

alta expressão de TLR2 e TLR4, e a baixa expressão de IL12, IFN- γ, iNOS no fígado.

Correlação entre o número de sinais clínicos em cães naturalmente infectados por

Leishmania infantum, assintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos

(n=19) e os níveis de expressão de RNAm de TLR2 (A), TLR4 (B), IL-12 (C), IFN- γ (D) e iNOS (E) realizado por meio de PCR em tempo real no tecido hepático. Os resultados estão expressos em gráficos de dispersão de valores individuais obtidos através da correlação de Spearman. As linhas conectoras representam os índices de correlação positiva e negativa.

5 DISCUSSÃO

Durante um processo infeccioso, a geração da resposta imunológica adequada é o ponto crucial que distingue entre o desenvolvimento dos padrões de suscetibilidade, resistência ou tolerância (IWASAKI e PILLAI, 2014). Os mecanismos desencadeados durante a infecção por parasitos do gênero Leishmania são altamente complexos e influenciados pela genética tanto do parasito, quanto do hospedeiro e também pelos componentes da saliva do inseto vetor. Muito embora essa complexidade dificulte e retarde estudos para o desenvolvimento de vacinas, por exemplo, houve um avanço significativo no entendimento da biologia da interação Leishmania versus hospedeiro nos últimos anos (KAYE e SCOTT, 2011) O sequenciamento do genoma de diversas espécies de Leishmania (PEACOCK et al, 2007), as análises da era pós-genômica (KAYE e BLACKWELL, 2008), o estudo das interações com o vetor (DOBSON et al, 2010; SADLOVA et al, 2010), e a melhor compreensão da imunologia e da biologia celular, bem como das interações entre o parasito e seus diversos hospedeiros, são exemplos de pesquisas que tem permitido contribuir para a construção desse conhecimento. No presente estudo, nós buscamos entender o padrão de expressão de receptores da imunidade inata em hospedeiros caninos naturalmente infectados com L. infantum e sua relação com o desenvolvimento da doença.

Os receptores da imunidade inata reconhecem padrões moleculares associados a patógenos, e ativam mecanismos de sinalização intracelular levando à produção de citocinas e direcionando à imunidade adaptativa (TAKEUCHI e AKIRA, S., 2010). Estudos sobre a importância de TLRs e NLRs na LVC são escassos e preliminares. Em virtude desse importante papel desempenhado pelos receptores na interface entre as respostas inata e adaptativa, e objetivando compreender os mecanismos imunológicos que levam a modulação da produção de citocinas protetoras contra à infecção por L. infantum em cães, nós investigamos o padrão de expressão de RNAm de receptores da imunidade inata e citocinas em grupos de cães assintomáticos, oligossintomáticos, sintomáticos e controles não infectados. Nossos dados mostraram que a expressão de transcritos para TLR1, TLR5, TLR7 e TLR8 foi regulada positivamente nos cães sintomáticos. Não há, entretanto, ligantes de Leishmania descritos para esses receptores, e essa alta expressão em cães sintomáticos portadores de LVC poderia ser estimulada por outras infecções

associadas. A debilidade imunológica dos animais sintomáticos permite a instalação de diversas infecções oportunistas nos cães, como por exemplo a conjuntivite bacteriana, muito frequente, o que poderia influenciar a expressão de TLRs não relacionados ao reconhecimento de Leishmania. Por exemplo, o dímero TLR1-TLR2 reconhece PAMPs de bactérias gram-positivas; TLR5 reconhece a flagelina de algumas bactérias gram-positivas e negativas; o dímero TLR7-TLR8 é responsável pelo reconhecimento do RNA viral de fita simples (TAKEUCHI e AKIRA, 2010; KAWAI e AKIRA, 2011). Estes PAMPs estão presentes em microorganismos que causam infecções oportunistas concomitantes em cães imunologicamente debilitados portadores de LVC, tais como cistites, infecções cutâneas na pele causada por bactérias (piodermites), dermatites fúngicas (ex.: malasseziose), pneumonias bacterianas, dermatofitoses, conjuntivite virais e bacterianas (CAVALCANTI, et al, 2004; CAFARCHIA et al, 2008; MYLONAKIS et al, 2014; ANDRADE et al, 2014; KRAWCZAK et al, 2015; DINCER et al, 2015).

De maneira interessante, os transcritos para TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9 também foram regulados positivamente no tecido hepático de cães sintomáticos. Esses receptores já foram descritos como tendo papel no reconhecimento de padrões moleculares presentes na Leishmania, em modelo murino e em células humanas, em que auxiliariam a fagocitose do parasito e induziriam a produção de TNF-α, IL-12 e NO (BECKER et al, 2003; KROFF et al, 2004a; KROFF et al, 2004b; FLANDIN et al, 2006; SCHLEICHER et al, 2007). No modelo canino, entretanto, nós acreditamos que a regulação positiva do RNAm desses TLRs se deve ao fato de os animais sintomáticos apresentarem maior parasitismo hepático, quando comparado àqueles assintomáticos (MAIA e CAMPINO, 2012; NASCIMENTO et al, 2015; HOUSEIN et al, 2016), e o maior estimulo antigênico seria responsável pela maior indução desses TLRs nesse grupo de animais, em um mecanismo de feedback positivo. Corroborando essa hipótese, observamos que a elevada expressão de RNAm para TLR2 e TLR4 foi correlacionada positivamente com o número de sinais clínicos apresentados pelos cães. De fato, a alta expressão de TLR2 e TLR4 já foi relatada no fígado, linfonodo, cólon e jejuno de cães portadores de LVC (FIGUEIREDO et al, 2013; MELO et al, 2014a; HOUSEIN et al, 2015). Esses mesmos TLRs estariam envolvidos com a fagocitose de L. donovani e atividade da iNOS (Kropf et al., 2004a; Flandin et al., 2006). Ademais, a alta expressão de TLR2

e TLR9 correlaciona-se ao parasitismo hepático em cães experimentalmente infectados por L. infantum (HOUSEIN et al, 2015).

Foi demonstrado também que o reconhecimento de moléculas de Leishmania por TLRs estimula vias de sinalização intracelulares dependentes de MAPks e NFκβ, regulando a produção de citocinas, ROS e NO, e, portanto, exerce papel no controle do parasitismo (BECKER et al, 2003; VEER et al, 2003). Na leishmaniose visceral provocada por L. donovani, foi observado que TLR9 é requerido para a ativação de células NK (SCHLEICHER et al, 2007) e essencial na produção de IL-12 por células dendríticas infectadas com L. infantum (SACRAMENTO et al, 2015). Também, a ativação de células dendríticas na infecção por L. major é dependente de TLR9/DNA a qual favorece o desenvolvimento de resposta Th1 e consequente resolução da lesão (BOU FAKHER et al, 2009).

É notável que os TLRs desempenham um grande papel na proteção contra infecções por Leishmania, incluindo a infecção por L. infantum em cães. Contudo os mecanismos de inibição da sinalização desses receptores necessitam ser melhor investigados para poder dar subsídios para o desenvolvimento de estratégias profiláticas para o controle da LVC.

Outra classe de receptores da imunidade inata que pode atuar na reposta imune durante a infecção por L. infantum em cães são os NLRs. Esses receptores podem ser ativados tanto pelo reconhecimento de moléculas microbianas, quanto por fatores endógenos liberados pelo tecido submetido à destruição (MEYLAN; TSCHOPP e KARIN, 2006). Neste trabalho, a análise dos NLRs demonstrou que cães oligossintomáticos e sintomáticos aumentam a expressão de transcritos para NLRP1, NLRP3, NOD1 e NOD2 quando comparado aos controles não infectados, assim como de IL-1β, cuja indução é mediada pelo inflamassoma. A ativação de inflamassomas leva ao recrutamento de caspases inflamatórias, contribuindo significativamente para o aumento da inflamação e pode causar lesão tecidual. Em modelo murino foi demonstrado que a ativação do inflamassoma de NLRP3 leva a restrição da replicação intracelular dos parasitos, devido a produção de IFN-γ e processamento de IL-1β, conduzindo ao aumento na expressão de iNOS, enzima relacionada com a restrição da replicação de Leishmania em macrófagos mediada pela produção de NO (GREEN, 1990; MUKBEL et al, 2007; LIMA-JUNIOR et al,

2013). De maneira contrária, NLRP3 apresentou função patogênica na infecção de camundongos Balb/c com L. major. Camundongos Balb/c nocautes para NLPR3, ASC e CASP1 apresentam edema e carga parasitária reduzidos, quando comparado a animais WT (selvagens) (GURUNG et al, 2015). Estudos sobre os mecanismos envolvidos neste papel patogênico demonstram que a IL-18 promove a sobrevivência da L. major por induzir ao perfil de resposta imune Th2 e produção de IL-4 (GURUNG et al, 2015). Nossos dados mostraram que os cães oligossintomáticos naturalmente infectados por L. infantum aumentam bastante a expressão de RNAm para IL-1β porém a expressāo de NLRP3 permanece semelhante aos animais assintomáticos. Esse dado pode ser explicado devido ao fato de a expressão de RNAm de IL-1 β não ser dependente de inflamassoma, somente a clivagem da proteína pró-IL-1β na proteína ativa IL-1β, pronta para ser liberada. Shio e colaboradores mostraram que a GP63 de Leishmania inibe diretamente a ativação de NLRP3 e secreção de IL-1β (SHIO et al, 2015). Mecanisticamente, GP63 inibe a produção de ROS necessária para a ativação do inflamassoma de NLRP3. Além disso, a GP63 também induz a clivagem de NLRP3.

Corroborando nossos dados, a infecção murina também aumenta a expressão de NOD2, e a via de sinalização de NOD2-RIP2 em células dendriticas é importante para a produção de IL-12 via fosforilação de MAPK, induzindo perfil de células Th1, importante para controle da infecção (NASCIMENTO et al, 2016).

Nesse estudo, nós observamos que o fígado de cães sintomáticos naturalmente infectados com L. infantum possuem alta expressão de transcritos para TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR3, TLR7, TLR8), NLRP1, NLRP3 e NOD1, porém baixa para IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ e iNOS, quando comparado com os cães do grupo assintomático. Esse dado, aparentemente conflitante, traz à luz a necessidade de se estudar e compreender melhor os mecanismos de modulação das diferentes vias de respostas produtoras de citocinas, ativação da iNOS e eliminação do parasito. Vale ressaltar a importância de verificar também: a expressão da proteína, visto que a regulação positiva de vários transcritos pode estar relacionada com vias compensatórias em virtude de possíveis mecanismos de regulação da expressão proteica; é possível que polimorfismo pra IL10 esteja envolvido ou fatores ligados ao reparo de DNA em uma fase anterior; além do que é provável que os genótipos diferentes da L. infantum estejam envolvidos na

imunomodulação; tipos de raças dos cães, variabilidade individual no hospedeiro. Estes são fatores plausíveis a serem especulados futuramente pelo nosso grupo de pesquisa.

Ainda, parasitos do gênero Leishmania podem inibir diversas moléculas participantes das vias de sinalização de TLRs, como mecanismos de evasão da resposta imune, de modo que mesmo tendo aumento da expressão dos receptores, sua sinalização é defeituosa devido mecanismos de regulação downstream (SACKS e SHER, 2002). De fato, já foi descrito que a L. donovani modula a ativação da MAPK p38 mediada pelo TLR2, suprimindo a produção de IL-12 e conduzindo ao aumento do parasitismo e desenvolvimento da forma sintomática da LV (CHANDRA e NAIK, 2008). Ainda, macrófagos e células dendríticas infectadas com Leishmania são refratárias a ativação de TLR por LPS (OLIVIER et al, 2005; CAMERON et al, 2004; CARRERA et al, 1996). A glicoproteína GP63, presente em Leishmania, medeia à ativação da proteína tirosina fosfatase (SHP-1) a qual se liga nas principais quinases (a via JAK/STAT, e MAPKs) presentes na via de sinalização dos TLRs, inibindo sua ativação (Revisado por ABU-DAYYEH et al, 2008). Assim, especula-se que os cães portadores de LVC poderiam ter inibição nas vias de sinalização dos TLRs, falha na ativação de macrófagos e comprometimento da resposta imune com disseminação do parasito.

O conhecimento de que cães sintomáticos naturalmente infectados por L.

infantum exibem diminuição significativa da expressão do RNAm para IL-12, IL-10,

IFN-γ e iNOS no tecido hepático já é bem consolidado (CORREA et al, 2007; HOSEIN et al, 2015; NASCIMENTO et al, 2015). O IFN-γ, em conjunto com TNF-α induz a expressão da enzima iNOS em células de Kupffer infectadas e auxilia na formação do granuloma hepático e ativação de mecanismos leishmanicidas pelas células (STANLEY e ENGWERDA, 2007). A produção deficiente destas citocinas nos órgãos alvo do parasito está relacionada com a progressão da leishmaniose visceral canina e ao alto parasitismo (PINELLI et al, 1994; CORREA et al, 2007; MAIA e CAMPINO, 2012; TURCHETTI et al, 2015; NASCIMENTO et al, 2015). Por outro lado, cães naturalmente infectados com L. infantum apresentam altos níveis de TGF-β e IL-10 no fígado, e estas citocinas foram detectadas em concentrações maiores que o IFN-γ, sugerindo que apesar de serem encontradas citocinas Th1 (IFN-γ) nos grupos sintomáticos e assintomáticos há predominância de citocinas Th2

(TGF-β e IL-10) que determinam a progressão da doença e aparecimento dos sintomas (CORREA et al, 2007).

Este estudo gerou novos conhecimentos envolvendo receptores da imunidade inata (TLRs e NLRs) na leishmaniose visceral canina (LVC), podendo servir de base para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ou susceptibilidade a infecção por L. infantum em cães, bem como dar subsídio a estratégias profiláticas para o controle da LVC.

6 CONCLUSÕES

A infecção natural por L. infantum conduz ao aumento na expressão de todos os receptores do tipo Toll (TLR1-TLR9), do tipo NOD (NOD1, NOD2, NLRP1 e NLRP3) no tecido hepático.

Cães sintomáticos apresentam maior expressão de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, NLRP1, NLRP3, NOD1 e IL-1β no fígado. Entretanto, estes animais apresentam baixa expressão de RNAm de IFN-γ, IL-12, IL-10 e iNOS no fígado, que poderia ser consequência da inibição de algumas vias de TLRs e NLRs.

Por outro lado, a infecção assintomática em cães foi correlacionada a alta expressão de RNAm de IFN-γ, IL-12 e iNOS, responsáveis por controlar o parasitismo e evitar o desenvolvimento da leishmaniose visceral canina.

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