Effet de la voie PP2A sur la régulation de MDR-1

Figure 4.15: Action de la Cbl et de la SAM sur la PLD, la P-Akt et le MDR-1. La

cobalamine et/ou la SAM conduisent à une augmentation de l’activité de la PLD, à une diminution de l’expression de la protéine phospho-Akt et à une diminution de l’expression du gène MDR-1.

Pour étudier un peu plus la relation entre Akt et MDR-1, nous allons poursuivre le travail en nous focalisant sur les trois voies agissant sur Akt qui ont été choisies. Nous utilisons, alors, des activateurs et/ou des inhibiteurs des voies PP2A, MEK et PI3K et nous observerons leurs effets sur l’expression du gène MDR-1.

2.3. Effet de la voie PP2A sur la régulation de MDR-1.

La première voie étudiée sera celle de PP2A, qui régule les décisions de survie ou de mort cellulaire, via la voie Akt, selon le contexte (Andrabi et al., 2007; Liu et al., 2003). En plus, il a été récemment démontré qu’une carence en Cbl influencait le degré de phosphorylation de la PP2A, dans le cas du neuroblastome (Battaglia-Hsu et al., 2009). La PP2A est une phosphatase, qui est connue pour diminuer la phosphorylation d’Akt en P-Akt. Un inhibiteur, l’acide okadaïque, et un activateur, l’acide palmitique, de cette protéine seront utilisés, afin de vérifier l’effet de cette voie sur l’expression du gène MDR-1.

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Nous montrons que l’acide okadaïque (Fig.4.16) augmente l’expression de P-Akt d’environ 87% (de 1±0.02 pour le témoin (control), à 1.87±0.15), alors que lorsqu’il est associé à la Cbl, l’expression de P-Akt ne s’élève qu’à 1.56±0.11). L’acide palmitique, en revanche, provoque une diminution de l’expression de P-Akt (de 1±0.02 à 0.64±0.03) et lorsqu’il est associé à la Cbl, cette diminution est encore plus prononcée (0.37±0.10).

Nous montrons ici, par cette expérience, un effet de ces deux composés sur l’expression de la P-Akt. La PP2A est connue pour inhiber la protéine phospho-Akt. En utilisant un inhibiteur de la PP2A, l’acide okadaïque, nous levons l’action d’inhibition de la PP2A sur P-Akt. Une inhibition, qui annule l’autre, a comme résultat l’activation de la cible finale. C’est exactement ce que nous obtenons. L’expression de la P-Akt augmente de 87% quand nous utilisons l’acide okadaïque. La combinaison de ce produit avec la cobalamine conduit à une augmentation de l’expression de la P-Akt de 56% par rapport au témoin et à une diminution de 30% par rapport à la condition où une association d’acice okadaïque et de Cbl est ajoutée aux cellules. Nous avons vu précédemment que la Cbl seule diminuait l’expression de P-Akt d’environ 70%. Ici son effet n’est pas aussi prononcé puisqu’il est contrebalancé par celui de l’acide okadaïque. Ceci pourrait être un indicateur du fait que la Cbl pourrait agir sur la P-Akt via PP2A.

L’acide palmitique est un activateur de la PP2A. Nous rappelons que la PP2A inhibe la P-Akt. Donc une activation de l’inhibition doit résulter à une inhibition de la cible finale, qui est la P-Akt. C’est aussi le cas. L’acide palmitique seul diminue l’expression de la P-Akt de 35% par rapport au témoin. Son association à la Cbl conduit à une diminution de la P-Akt de 60%. La Cbl renforce l’effet de l’acide palmitique de 25%. Ceci aussi constitue un indicateur que la Cbl agisse sur P-Akt par la voie de la PP2A.

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Figure 4.16: Implication des effecteurs de la PP2A sur l’expression de la protéine phospho-Akt. Étude de l’expression de la protéine P-Akt, par Western blot, en présence ou absence de

100 nM de cobalamine (Cbl) associée ou non à 100µM d’acide okadaïque (OA) ou à 100µM d’acide palmitique (Palm) (P-Akt/Akt en unités arbitraires ; * : p<0.01 par rapport au témoin (control). Cette figure est représentative de 3 expériences différentes. (Fiche technique n°13).

Il existe une méthylase intéressante dans le cadre de cette étude qui est la protéine phospatase méthyl transférase (PPMT). Cette transférase permet une modification postraductionnelle de la PP2A par méthylation. Il s’agit ici pour nous de voir si la Cbl, en activant la génération de SAM conduirait à une méthylation de cette transférase. L’étude de la méthylation de PP2A a été recherchée par Western-blotting. Nous observons (Fig.4.17) que la protéine PP2A méthylée est exprimée dans les cellules HepG2 (témoin : 1±0.02), et que cette méthylation est augmentée quand les cellules sont incubées avec de la Cbl (2.33±0.28).

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Figure 4.17: Influence de la cobalamine sur l’expression de la Me-PP2A. Étude de

l’expression de la protéine Me-PP2A, par Western blot, en présence ou en absence de 100 nM de cobalamine (Cbl) (Me-PP2A/PP2A en unités arbitraires ; * : p<0.01 par rapport au témoin (control). Cette figure est représentative de 3 expériences différentes. (Fiche technique n°13).

La PP2A est une protéine présente dans les cellules HepG2. Elle est régulée par méthylation grâce à la méthyltransférase PPMT qui est une transférase SAM dépendante. La Cbl, comme nous avons vu précédemment, active la méthionine synthase et ainsi le cycle de la méthionine, qui est le donneur cellulaire des méthyles, méthyles utilisés par la suite pour la méthylation de PP2A. En conséquence, nous suggérons, à partir de notre résultat, que la Cbl pourrait agir en partie sur l’expression de la protéine P-Akt en activant le cycle de la méthionine, puis en provoquant la méthylation de la PP2A qui va par la suite inhiber la phosphorylation d’Akt.

Nous avons alors recherché quel pouvait être l’effet de ces effecteurs de la PP2A, sur l’expression du gène MDR-1.Les résultats sont présentés dans la figure 4.18. L’inhibiteur de PP2A, l’acide okadaïque, conduit à une augmentation de l’expression du gène MDR-1 par

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rapport au témoin (passant de 1±0.01 à 1.53±0.04). Cette augmentation est annulée quand il est ajouté en association à la Cbl (1.04±0.01).

Figure 4.18: L’action de l’acide okadaïque, inhibiteur de la PP2A, sur l’expression du gène MDR-1. Étude de l’expression du gène MDR-1, par qRT-PCR, en présence ou absence de

100 nM de cobalamine (Cbl); de 10nM d’acide okadaïque (OA); ou d’un mélange de 10nM de d’acide okadaïque et de 100 nM de cobalamine (OA+ Cbl). * : p<0.01 par rapport au témoin (control). Cette figure est représentative de 3 expériences différentes. (Fiche technique n°18).

L’acide okadaïque est un inhibiteur de la PP2A. La PP2A elle-même inhibe la protéine Akt. Nous avons vu précédemment que l’acide okadaïque provoquait une augmentation de l’expression de la P-Akt et, aussin comme nous le constatons ici, une augmentation de l’expression du gène MDR-1 de 50% par rapport au témoin. Il est clair alors que, dans les cellules HepG2, l’expression du gène MDR-1 est influencée par la PP2A via la voie Akt.

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Lorsque nous ajoutons aux cellules un mélange de Cbl et d’acide okadaïque, nous voyons que la Cbl diminue l’augmentation de l’expression du gène MDR-1, provoquée par l’acide okadaïque. Il semblerait donc, que la Cbl agisse sur l’expression du gène MDR-1 en influençant la PP2A et ensuite P-Akt.

A l’inverse, l’activateur de PP2A, l’acide palmitique, provoque une diminution de l’expression de MDR-1 par rapport au témoin (de 1±0.01 pour le control, à 0.50±0.01) (Fig.4.19) et cette diminution est plus importante quand ce l’acide palmitique est ajoutéen combinaison la Cbl (0.43±0.03).

Figure 4.19: Action de l’acide palmitique, activateur de la PP2A, sur l’expression du gène MDR-1. Étude de l’expression du gène MDR-1, par qRT-PCR, en présence ou absence de

100 nM de cobalamine (Cbl);de 100µM d’acide palmitique (Palm); d’un mélange de 100µM de d’acide palmitique et de 100 nM de cobalamine (Palm+ Cbl). * : p<0.01 par rapport au témoin (control). Cette figure est représentative de 3 expériences différentes. (Fiche technique n°18).

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L’acide palmitique active la PP2A et nous avons observé qu’il diminuait la formation de la P-Akt. Ici, nous constatons que, l’acide palmitique conduisait également à une diminution de l’expression du gène MDR-1 de 50% par rapport au témoin. Ici encore, nous pouvons raisonnablement émettre l’hypothèse que la voie de la PP2A influence le gène

MDR-1, probablement via son action sur la voie Akt.

Quand l’acide palmitique est associé à la Cbl, la diminution de l’expression du gène

MDR-1 est de 57% par rapport au témoin et de 7% par rapport à la condition d’utilisation de

l’acide palmitique seul. L’effet de la Cbl sur l’expression du gène MDR-1 pourrait passer par la voie PP2A, inhibitrice de celle d’Akt.

Pour résumer, si nous intégrons nos différents résultats, nous pouvons proposer la chaîne métabolique suivante : la Cbl active le cycle de la méthionine, qui conduit à une activation des méthyltransférases, telles que la PPMT. La PPMT méthyle la protéine PP2A et donc la rend active. Cet effet peut être obtenu également par l’acide palmitique. Une activation de PP2A conduit à une diminution de l’expression de la protéine P-Akt, puisque la voie PP2A est une voie inhibitrice de celle d’Akt. L’activation de la voie PP2A par la Cbl ou par l’acide palmitique a aussi comme résultat la diminution de l’expression du gène MDR-1 (Fig.4.20). Il n’est pas à exclure que la Cbl agisse sur Akt ou même sur MDR-1 aussi partiellement par des voies parallèles et indépendantes de la voie PP2A. Ces résultats attirent notre attention puisque, une vitamine et un acide gras réussissent à diminuer l’expression de l’acteur principal de la chimiorésistance, le gène MDR-1. Ceci pourrait être une voie métabolique, sur laquelle nous pourrions agir avec des produits combinés à la cobalamine, afin peut être d’éviter ou de limiter le phénomène de chimiorésistance.

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Figure 4.20 : Lien possible entre la Cbl, la Me-PP2A, Akt et MDR-1. L’acide palmitique,

mais aussi la cobalamine augmentent l’expression de la Me-PP2A et conduisent à la déphosphorylation de la protéine Akt qui est accompagnée d’une diminution de l’expression du gène MDR-1.

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