Effet de Rab11 SN sur la distribution des RTKs actifs et d’autres protéines de migration

Dans l’étude publiée par le groupe de Pernille Rorth, il a été suggéré qu’une fonction possible de Rab5 et de la Rab5GEF : Sprint serait le recyclage polarisé des RTKs actifs ou d’un facteur qui maintient les récepteurs actifs au front de migration (Jekely, Sung et al. 2005). Par conséquent, le trafic Rab11-dépendant à travers l’endosome de recyclage pourrait être une station importante dans un tel cycle de transport. De plus, il est connu que d’autres protéines impliquées dans la migration, en particulier les protéines d’adhésion : E- cadhérines et intégrines sont recyclées par une voie Rab11-dépendante (Le, Yap et al. 1999;

Lock and Stow 2005; Caswell and Norman 2006). Pour cela, nous avons décidé de tester la localisation de ces protéines au début de la migration dans des cellules de bord contrôles, ainsi que dans des cellules exprimant Rab11 dominant négatif à 29ºC.

3.3.1. L’observation de la localisation des protéines de migration au microscope confocal

Nous avons eu recours à la technique d’immunomarquage (Voir chapitre matériels et méthodes), puis à l’imagerie par immunofluorescence des chambres d’œufs afin de déterminer la localisation des protéines de migration au sein des cellules de bord.

Nous avons regardé d’abord la distribution de la chaîne béta d’intégrine dans le groupe de cellules de bord au début de la migration. En effet, β-intégrine est la seule intégrine exprimée dans ces cellules au stade 9 où elles commencent à migrer (Dinkins, Fratto et al. 2008). C’est ainsi que nous avons pu observer un faible signal hétérogène de β- intégrine au niveau des jonctions cellulaires entre les cellules de bord du groupe. De plus, nous n’avons pas trouvé de différences évidentes dans cette distribution de β-intégrine entre les cellules de bord contrôles et celles qui expriment Rab11SN (Voir figure 17).

Ensuite, nous avons testé la localisation de DE-cadhérine. Nous avons trouvé ainsi une distribution de cette protéine semblable à ce qui a été décrit précédemment dans la littérature (Niewiadomska, Godt et al. 1999). En effet nous observons une accumulation de DE-cadhérine au niveau des contacts cellulaires entre les deux cellules polaires, et un enrichissement au front de migration par rapport à l’arrière de ces cellules. De nouveau, cette localisation de DE-cadhérine est similaire dans les cellules de bord contrôles et dans celles où Rab11SN est sur-exprimé (Voir figure 17).

Finalement, nous avons regardé la distribution de la phospho-tyrosine (p-Tyr). Cette dernière ayant déjà été utilisée comme marqueur de l’activité des RTKs dans les cellules de bord. Comme publié précédemment (Jekely, Sung et al. 2005), nous avons trouvé une nette

polarisation du signal de p-Tyr dans les cellules de bord au début de leur migration. En effet, nous observons un enrichissement de la p-Tyr au front migration en comparaison avec l’arrière des cellules. Ce signal est similaire à celui de DE-cadhérine, sauf qu’il n’est pas limité aux cellules polaires. Cependant, contrairement à DE-cadhérine, la distribution de p-Tyr est modifiée de façon significative suite à la sur-expression de Rab11SN, qui entraîne une perte de la polarisation (Voir figure 17).

CD8-GFP / ADN (DAPI)

Figure 17: Distribution des protéines de migration dans des cellules de bord contrôles

et des cellules exprimant Rab11SN. Les images en noir et blanc reproduisent le canal rouge séparé

3.3.2. La quantification de la distribution spatiale du signal relatif aux protéines de migration

Pour confirmer nos observations visuelles, nous avons quantifié, utilisant le programme « Image J », la fluorescence dans deux régions étroites qui correspondent à la membrane plasmique respectivement au niveau du front de migration, et de l’arrière du groupe de cellules de bord. Nous avons effectué cette mesure sur 3 plans focaux consécutifs séparés d’1µm. Pour être impartial, nous avons décidé de choisir comme plan focal central celui où les deux cellules polaires apparaissent le plus nettement. Les cellules polaires étant assez faciles à identifier parce qu’elles expriment le plus bas niveau de GFP. Le signal GFP nous a servi aussi à déterminer la position du cortex cellulaire au niveau du front et de l’arrière du groupe des cellules de bord. Ensuite, nous avons calculé le rapport de la fluorescence au front de migration (région postérieure) divisée par la fluorescence à l’arrière des cellules de bord (région antérieure) (Voir figure 18). Si la distribution du signal de fluorescence est égale dans les deux régions délimitées, la valeur de ce rapport sera proche de 1.

Nous avons commencé d’abord par évaluer ce rapport de fluorescence dans des cellules de bord contrôles. Dans chaque cas, l’erreur correspond à l’erreur-type de la moyenne, et « n » désigne le nombre de chambres d’œufs examinées où les cellules de bord commencent à migrer. La GFP soluble est prise comme référence, et effectivement nous avons obtenu pour la GFP une valeur du rapport de fluorescence proche de 1 (rapport =1.03 ± 0.04, n=56). Par contre, la mesure du rapport de fluorescence postérieure divisée par la fluorescence antérieure pour le signal de DE- cadhérine est de 1.7 ± 0.17 (n=13). Ceci signifie que le signal de DE-cadhérine est enrichi au front de migration en comparaison à l’arrière des cellules. Par contre, le signal de β-intégrine est légèrement enrichi à l’arrière étant donné que le rapport de fluorescence postérieure/antérieure correspondant est de 0.78 ± 0.04 (n=13). Finalement, le signal de p-Tyr est à son tour enrichi au front de migration (rapport=1.6 ± 0.13, n=22), ce qui confirme notre observation initiale et les données déjà publiées.

Nous avons effectué en parallèle une mesure du rapport de fluorescence de ces mêmes marqueurs suite à la sur-expression de Rab11SN. Comme prévu, le signal de la GFP n’est pas modifié de façon significative entre les cellules de bord contrôles et celles exprimant Rab11SN. De même, ce signal présente toujours une distribution égale dans la région postérieure et la région antérieure (rapport=1.1 ± 0.05 n=50). D’autre part, ni l’enrichissement postérieur de β-intégrine (rapport=0.80 ± 0.06, n=14) ni l’enrichissement antérieur de DE-cadhérine (rapport=1.57 ± 0.16, n=16) ne sont affectés par la perturbation du trafic à travers l’endosome de recyclage suite à l’expression de Rab11SN. Au contraire, la polarisation du signal de p-Tyr disparaît complètement suite à l’expression de Rab11SN, confirmant ainsi notre observation initiale (rapport =0.91 ± 0.11, n=20). Remarquablement, le niveau total de l’intensité de la fluorescence de p-Tyr est similaire entre les cellules de bord contrôles et celles exprimant Rab11SN. Ceci suggère que l’expression de Rab11SN affecte uniquement la distribution (postérieure/antérieure) et non le niveau de p-Tyr.

Figure 18 : Quantification du signal de fluorescence des protéines de migration au front et à l’arrière des cellules de bord

En conclusion, ces résultats supportent l’importance du transport Rab11- dépendant à travers l’endosome de recyclage dans la migration des cellules de bord. En effet, ils suggèrent que ce compartiment est impliqué spécifiquement dans la polarisation de l’activité des RTKs dans les cellules de bord, sans toutefois affecter la polarité d’autres protéines de migration comme les intégrines et la DE-cadhérine.