4.3 Effet des extraits végétaux sur la formation de biofilms microbiens
4.3.2 Effet de l’extrait acétonique des graines de cumin
Les résultats de nos expériences ont indiqué que les pourcentages d’inhibition du biofilm des souches testés à savoir E. faecalis, S. epidermidis, C. albicans 3 ainsi que C.
albicans ATCC 10231 ont augmenté avec l’augmentation de la dose de l’extrait acétonique de
cumin (Figure 69). D’après les résultats obtenus, on remarque que l’épaisseur du biofilm est d’autant plus faible que la concentration de l’extrait est importante, une inhibition significative a été observée lorsque les extraits étaient utilisés à une dose de 50% CMI et CMI (P <0,05).
Les plus fortes réductions de biofilms ont été observées avec les plus grandes concentrations (CMI) et ceci avec C. albicans ATCC 10231, avec un pourcentage d’inhibition de 85.91 % suivie par E. faecalis avec une réduction de biofilm de 75.41%, cependant notre extrait de cumin a eu un effet statistiquement similaire sur l’inhibition de biofilm de toutes nos souches microbiennes testées, à une concentration de CMI, notre extrait a eu des pourcentages d’inhibition > 50%, ce qui démontre une activité élevée contre les souches (Famuyide et al., 2019).
145
Figure 69. L'effet de l’extrait acétonique de cumin sur la formation des biofilms microbiens.
Les valeurs représentent les moyennes ± erreurs standard pour trois répétitions. Différentes lettres indiquent une différence significative les unes des autres (p <0.05).
Les biofilms influencent directement la virulence et la pathogénicité d'un agent pathogène, il est optimal d'employer une stratégie qui inhibe efficacement la formation de biofilm (Bakkiyaraj et al., 2013). L’émergence de bactéries résistantes, ainsi que l’utilisation de médicaments allopathiques dans les soins bucco-dentaires qui ne sont pas efficaces pour éradiquer complètement les agents pathogènes buccaux; au contraire, ils se sont avérés cytotoxiques. Ainsi, il est optimal d'employer une stratégie qui inhibe efficacement la formation de biofilm, les produits dérivés des plantes sont de choix contre les agents pathogènes oraux (Geethashri et al., 2014).
Dans ce contexte, les résultats obtenus par Amalia et al. (2019), ont démontré un effet antimicrobien de l’extrait de cumin qui était meilleur que celui de la chlorohexidine à 2% contre E. faecalis isolé de la cavité buccale avec une parodontite. De plus ils ont affirmé l’effet de l’extrait de C. cyminum contre la formation de biofilm d’E. faecalis, ce qui concorde avec nos résultats. En outre, les travaux réalisés par Singh et al. (2016), ont démontré un effet modéré de l’extrait méthanolique du cumin dans l’inhibition des mécanismes de QS
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
E.faecalis S.epidermis C.albicans 3 C.albicans ATTC
10231 P ou rc en tage s d 'i n h ib ition % 6.25% CMI 12.5% CMI 25% CMI 50%CMI CMi a ab b c c a b c c a a b b b a b bc cd C. albicans ATCC 10231 S. epidermidis CMI
Chapitre V : Résultats et discussion
146
basés sur AHL chez Cronobacter sakazakii ainsi que sa capacité à perturber les biofilms du pathogène. Cela peut être dû soit à une faible concentration d'extraits bruts utilisés dans leur étude, soit au mécanisme par lequel les composés affectent le système QS.
Des études réalisées par Derakhshan et al. (2017) ont révélé que l’extrait alcoolique de cumin avait le potentiel de réduire l’épaisseur de la capsule de K. pneumoniae, mais qu’il était incapable d’inhiber la formation de biofilm de cette souche. Par ailleurs, l’huile essentielle des graines de cumin a diminuée l'expression de la couche capsulaire de K.
pneumoniae et a également réduit de 50% ou plus de la formation de biofilm, ces résultats ont
montré que ces souches présentaient une capacité altérée (diminuée) à former un biofilm par rapport au témoin (Derakhshan et al., 2010).
Sybiya Vasantha Packiavathy et al. (2012) ont rapporté lors du traitement de bactéries pathogènes avec l’extrait méthanolique de C. cyminum, une inhibition de la formation de biofilm d’une valeur de 84 à 95%, 76 à 85% et 24 à 71% pour P. mirabilis, P.
aeruginosa PAO1 et S. marcescens, respectivement. Ces auteurs ont prouvé le potentiel
inhibiteur de la détection de quorum (QSI) de C. cyminum contre les expressions phénotypiques dépendantes du QS chez ces mêmes souches, Jayalekshmi et al. (2020) ont rapporté à leur tour que l'extrait méthanolique de cumin inhibait l'activité de détection de quorum en interférant avec la production de AHL et inhibait ainsi la formation de biofilm de l'organisme Aeromonas veronii.
Apparemment, le mode d’action du cumin peut être du aussi à sa réduction de la formation d’EPS qui sont importants au développement de l'architecture et de la maturation des biofilms, en effet Sybiya Vasantha Packiavathy et al. (2012) ont démontré l’atténuation de la formation de cette matrice par l’extrait de cumin chez des bactéries pathogènes, de ce fait il est possible que la résistance des cellules sessiles aux antibiotiques soit réduite. En plus des propriétés bioactives du cumin on peut lui rajouter le potentiel inhibiteur de la détection de quorum et antibiofim. Shayegh et al. (2008), ont évalué l’effet des huiles essentielles du cumin contre la formation de biofilm chez des bactéries isolées de la plaque supragingivale, ils ont constaté que ces huiles ont significativement diminué l'adhésion bactérienne et affecté la viabilité bactérienne dans les biofilms.
Conclusion
147
Conclusion
Les maladies bucco-dentaires, y compris les caries dentaires et les maladies parodontales, sont généralement causées par un large éventail de microorganismes associés au biofilm buccal ou à la plaque dentaire. En plus de ces maladies buccales, ces pathogènes opportunistes peuvent être impliqués dans diverses autres pathologies systémiques notamment l'endocardite bactérienne, la pneumonie, l'ostéomyélite, maladie coronarienne, infractus cérébral, le faible poids des nouveau-nés ainsi que des naissances prématurés. Les produits couramment utilisés pour réduire et inhiber la formation de biofilm, présentent certains inconvénients, notamment la pigmentation dentaire, la restauration des souches insensibles, la sensation de brûlure dans la bouche et l'altération de la sensation de goût. À cause de la haute résistance des biofilms aux antimicrobiens et au systéme immunitaire de l’hôte et les effets secondaires indésirables des thérapies existantes, de nombreux auteurs ont proposé des thérapies alternatives qui peuvent offrir des résultats satisfaisants sans entraîner de risques potentiels pour le patient. Les plantes médicinales sont des sources potentielles de nouveaux composés antimicrobiens et antibiofilms contre les microorganismes pathogènes, qui sont responsables de diverses infections humaines et animales.
Dans ce contexte nous, nous sommes intéressé à l’étude de deux plantes : fruit de P.
granatum (écorces) et les graines de C. cyminum en analysant leur composition chimique et
en évaluant quelques propriétés biologiques telles que, l’activité antioxydante, antimicrobienne et antibiofilm.
Les résultats de la détermination de la teneur en polyphénols, flavonoides et tanins ont démontré la richesse des extraits d’écorces de grenades par rapport à ceux du cumin. Pour les extraits de grenade c’est la macération avec l’éthanol qui a donné les meilleures teneurs en polyphénols et en flavonoides (204.67 ± 15.26 mg EAG/g MS, 67.67 ± 1.53 mg EQ/g MS respectivement), tandis que pour les tanins c’est l’acétone qui a donné les meilleurs résultats (220 ± 17.32 mg EC/g MS). Concernant les extraits de cumin, les teneurs les plus importantes ont été enregistrées avec l’extrait acétonique pour les polyphénols, flavonoides et tanins (42 ± 3.46 mg EAG/g MS), (24.49 ± 1.24 mg EQ/g MS) et (34.95 ± 8.71 mg EC/g MS) respectivement.
L’étude du pouvoir antioxydant par les tests de DPPH et de FRAP a montré que les extraits de grenades possédaient une grande activité, surtout dans le cas de la macération avec l’éthanol pour le test DPPH, où l’activité antioxydante de l’extrait éthanolique (EC50=220± 14 µg/ml) était statistiquement similaire à celle du témoin positif l’a. ascorbique (CE=200 ±
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26 µg/ml), en parallèle pour le test de FRAP c’est l’extrait acétonique qui a donné les meilleurs résultats et dont l’activité était similaire au témoin positif (p˂ 0.05). Néanmoins, dans les deux tests aucune différence statistique n’a été enregistrée dans l’activité entre les différents solvants. Dans le cas des extraits de C. cyminum, ces derniers possèdent un pouvoir antioxydant modéré. Les extraits acétoniques (CE=940 ± 42 µg/ml) et éthanoliques (CE=960 ± 50 µg/ml) ont exercé le meilleur effet antioxydant dans le test de DPPH tandis que pour le test de FRAP c’est l’extrait méthanolique qui s’est montré le plus performant. Dans le cas du cumin, on a observé également une similitude statistique dans la performance de l’activité antioxydante des différents solvants. Il est clair à partir des résultats, que les extraits de grenade possèdent un effet antioxydant beaucoup plus élevé que celui des extraits de cumin, ce qui concorde avec les teneurs élevées en polyphénols des extraits de grenade par rapport à ceux du cumin.
Les différents isolats testés dans cette étude, ont été isolés à partir des caries dentaires et de la plaque supragingivale, une sélection a été faite sur ces souches sur la base de leur capacité et performance à former un biofilm. Pour arriver à une sélection de 4 souches Gram+ (Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Gemella morbillorum, Staphylococcus
epidermidis), 2 souches à Gram- (Enterobacter bugandensis et Klebsiella oxytoca), 2 levures
(Candida albicans 3 et Candida albicans 4), ainsi qu’une souche de référence C. albicans ATCC 10231. Une identification génotypique a été effectuée pour confirmer l’identité de 4 de ces souches bactériennes Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter
bugandensis et Klebsiella oxytoca.
Au terme des essais réalisés sur l’activité antimicrobienne, il apparait que tous les extraits de grenades sont susceptibles d’inhiber tout nos germes responsables d’infections bucco-dentaires, avec une sensibilité qui diffère selon les souches avec des zones d'inhibition de l’ordre de 14.00± 0.06 à 34.00± 0.23 mm. G. morbillorum, S. epidermidis et les trois souches fongiques se sont montrés extrêmement sensible aux extraits de grenades. Concernant les extraits de cumin, ils se sont avérés efficaces contre toutes les bactéries Gram+ (à l’exception d’E. faecalis avec les extraits méthanolique et éthanolique) et les levures, mais inefficaces contre les bactéries à Gram-. Les plus grandes zones d’inhibition ont été notées à des diamètres de 23 mm contre C. albicans 4 (extrait éthanolique), 17.30 mm contre E.
faecalis (extrait acétonique) et 15 mm contre S. mutans (extrait méthanolique et acétonique).
En comparant entre les extraits de nos deux plantes, on a remarqué une activité antimicrobienne plus élevée pour les extraits de grenades, ceci est en corrélation avec les
Conclusion
149
teneurs élevées en polyphénols. Le changement des solvants pour nos deux plantes n’a eu aucun effet statistiquement significatif sur leurs pouvoirs antimicrobiens.
En comparant entre l’effet des extraits et celui des antibiotiques et des antifongiques testés, nous avons constaté que les extraits en particulier ceux de la grenade étaient plus actifs que les antimicrobiens standards, car ces derniers n’étaient pas tous actifs contre les souches testées contrairement aux extraits de grenades. De même pour les extraits de cumin qui avaient montrés un effet antifongique contre toutes les levures à l’opposé des antifongiques testés. Le plus grand halo d’inhibition a été enregistré par la Tétracycline contre G.
morbillorum (40 mm), tandis que pour les antifongiques il s’agit de l’Econazole (28mm)
contre C. albicans 3.
Les extraits d’écorces du fruit de P. granatum semblent exercer des effets inhibiteurs de type bactériostatique et fongistatique (avec des CMI comprises entre 0.0125 et 100 mg/ml) contre nos souches bactériennes et fongiques respectivement à l’exception d’E. bugandensis où un effet bactéricide a été observé avec les extraits éthanolique et méthanolique, de même pour G. morbillorum où les trois extraits d’écorces de grenade ont eu un effet bactéricide. Par ailleurs, pour les extraits de C. cyminum, une activité bactéricide et fongicide a été mise en évidence envers nos souches testées (avec des CMI comprises entre 12.5 et 200 mg/ml), néanmoins, une exception est à noter pour S. mutans ou une activité bactériostatique a été observée avec l’extrait méthanolique, de même pour l’extrait acétonique qui a eu un effet fongistatique contre C. albicans 3.
L’activité antimicrobienne exercée par les extraits d’écorces de grenades pourrait être attribuée au Péduncalagine, Punicalagine et Punigluconine, tandis que celle du cumin pourrait être liée à l’acide p-coumarique, Apigénine glucuronide, Apigénine-7-o-glucoside, Apigénine, Diosmine déterminés par HPLC.
Les résultats de l’activité antibiofilm montrent que le taux de formation des biofilms a diminué avec l’augmentation des concentrations des extraits d’écorces de grenades et des graines de cumin. Nos deux extraits ont montré une activité antibiofilm très intéressante envers les souches de C. albicans responsables de candidose buccale ainsi que chez les bactéries testées et qui sont responsables de diverses infections bucco-dentaires. L'inhibition maximale du biofilm par l’extrait éthanolique de grenade et acétonique de cumin a été observée à la plus grande concentration (CMI), où les plus fortes réductions de la production de biomasse de biofilm ont été observées avec E. faecalis (91.95%) et S. epidermidis (90.7%)
150
dans le cas de la grenade, et avec C. albicans ATCC 10231, (85.91 %) suivie par E. faecalis (75.41%) pour le cumin.
La transformation des fruits et légumes génère des quantités de déchets qui sont une source de sucres, de minéraux, d'acides organiques, de fibres alimentaires et de composés phénoliques qui ont un large éventail d'actions qui comprend des activités antioxydantes, antimutagènes, cardio-préventives, antibactériennes et antivirales. Ainsi, il pourrait être intéressant d'utiliser les écorces de grenade qui sont un sous produit de la fabrication des jus, ainsi que les graines de cumin pour leurs activités antioxydantes, antimicrobiennes et antibiofilms contre les pathogènes buccaux par leurs incorporation dans les chewing-gums, les bains de bouches, les dentifrices ainsi que dans l'élaboration de produits pour réduire les caries et la plaque dentaire et ceci en ayant des avantages économiques dans le cas des écorces de grenade.
Nos résultats constituent la première étape d’une recherche de substances de source naturelle biologiquement active, en perspectives les recommandations suivantes sont suggérées :
Utilisations d’autres techniques d’extraction et voir leurs impacts sur les teneurs en polyphénols.
Un meilleur fractionnement des constituants afin de caractériser les molécules responsables de ses activités.
Mener des études in vivo pour justifier et évaluer l'utilisation potentielle des extraits d’écorces du fruit de P. granatum et des graines de C. cyminum.
Evaluer la cytotoxicité des extraits d’écorces de grenade et des graines de cumin sur les cellules de fibroblastes gingivaux humains.
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