Effet de la composition lipidique de la SLB sur la production de l’alpha hémolysine-eGFP

1.3.Effet de la composition lipidique de la SLB sur la production de l’alpha

hémolysine-eGFP

/D ELFRXFKH OLSLGLTXH VXSSRUWpH ELRPLPpWLTXH PLVH DX SRLQW QRXV YRXORQV

PDLQWHQDQW GpWHUPLQHU VL FH W\SH GH 6/% HVW DGDSWp j OD SURGXFWLRQ GH SURWpLQHV

PHPEUDQDLUHV DOSKD KpPRO\VLQHH*)3 SDU XQ V\VWqPH &)36 PDLV pJDOHPHQW j

O¶LQFRUSRUDWLRQGHFHVSURWpLQHVGDQVODELFRXFKHOLSLGLTXH

/HV VROXWLRQV GH &)36 FRQWHQDQW RX QRQ WpPRLQ OH SODVPLGH SRUWDQW OH JqQH FRGDQW OD

SURWpLQH $+H*)3 RQW pWp LQMHFWpHV VXU GHX[ W\SHV GH 6/% O¶XQH FRPSRVpH GH GH

323&HWO¶DXWUHGHG¶H[WUDLWWRWDOG¶(FROL323&

)LJXUH 0HVXUHV GH O¶LQFRUSRUDWLRQ GH O¶DOSKD KpPRO\VLQHH*)3 HW G¶XQ FRQWU{OH VDQV SODVPLGH

DMRXWp GDQV OH &)36 SDU 4&0' VXU 6/%V IRUPpHVj SDUWLU GH VROXWLRQV GH OLSRVRPHV GH UDWLR PRODLUH

(FROL323&HW323&8QHIRLVOHV6/%VIRUPpHVODWHPSpUDWXUHGHODFKDPEUHGH4&0'

HVWDMXVWpHjƒ&$SUqVVWDELOLVDWLRQGHVVLJQDX[ODPHVXUHHVWUpLQLWLDOLVpHQRQPRQWUpVXUODILJXUHSXLVOHV

VROXWLRQVGH&)36VRQWLQFXEpHVSHQGDQWKHXUHVDYDQWULQoDJHDYHFGXWDPSRQGHVROXWLRQ

6XLWHjO¶LQMHFWLRQGHVVROXWLRQVGH&)36ODIUpTXHQFHGHUpVRQDQFHGLPLQXHUDSLGHPHQW

+] HQ UDLVRQ GX PDWpULHO GX V\VWqPH G¶H[SUHVVLRQ DMRXWp VXU OHV ELFRXFKHV

OLSLGLTXHV)LJXUH

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Lors de l’ajout du CFPS témoin sur une SLB composée exclusivement de molécules

lipidiques de POPC, nous notons une faible diminution de la fréquence (-160 Hz) qui ne varie

pas après 120 minutes d’expression. Le lavage de la chambre par le tampon s’accompagne

d’une remontée très rapide de la fréquence de résonance qui revient à la valeur initiale de 0

Hz indiquant que le matériel de CFPS ajouté sur la SLB est éliminé. Un comportement

similaire est observé pour le CFPS témoin incubé sur une SLB biomimétique.

Lors de l’incubation du CFPS contenant le gène de l’AH-eGFP sur une SLB composée

exclusivement de molécules lipidiques de POPC une diminution de la fréquence importante

et continue sur 3 heures est constatée. Le lavage effectué après 3 heures d’expression

protéique met en évidence une remontée des signaux à une valeur de -120 Hz signifiant que

du matériel est retenu sur la surface. Il en est de même pour l’expression d’AH-eGFP sur

une SLB biomimétique avec une valeur de production après de 3 heures légèrement plus

faible que sur POPC mais avec une valeur mesurée après le lavage identique.

Le même comportement est observé pour les témoins mais également pour l’expression

d’AH-eGFP sur les SLBs de deux compositions différentes. Les différences observées entre

l’AH-eGFP et le témoin sur les deux SLBs sont de -120 Hz dans les deux cas signifiant que

la protéine AH-eGFP est produite sur la surface. Ceci confirme qu’il n’y a aucun impact du

changement de composition lipidique de la bicouche lipidique supportée sur la production et

l’adsorption de protéines produites par un système CFPS.

Pour déterminer si les protéines sont incorporées dans les deux types de SLB, une

étude de la modification de viscoélasticité de surface a été réalisée. Pour cela, la variation de

la dissipation en fonction de la variation de fréquence de résonance a été tracé (Figure 113).

Figure 113 : Variations de la dissipation en fonction de la variation de fréquence obtenues pour

l’AH-eGFP et le témoin (sans ajout de plasmide dans le CFPS) par QCM-D sur des SLBs de composition A)

68% E.coli / 32%POPC et B) 100% POPC. Une fois les SLBs formées, la température de la chambre de QCM-D

est ajustée à 30°C. Après stabilisation des signaux, la mesure est réinitialisée (non montré sur la figure) puis les

solutions de CFPS sont incubées pendant 3 heures avant rinçage avec du tampon de solution.

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Le témoin incubé sur la SLB de composition 68 % d’extrait total d’E.coli et 32 % de

POPC montre une proportionnalité (de 0 à -130 Hz) entre la variation de la dissipation et la

fréquence de résonance (Figure 113 (A)) indiquant une absence de variation de la

viscoélasticité de la surface. Le même comportement est observé pour le témoin incubé sur

la SLB de composition 100 % de POPC.

Dans le cas où une solution de CFPS contenant le plasmide portant le gène de l’alpha

hémolysine-eGFP est injectée, nous observons une première pente linéaire (de 0 à -130 Hz)

pour laquelle la variation de dissipation est proportionnelle à la variation de fréquence. Puis,

une cassure de la pente apparait durant laquelle la dissipation varie moins vite que la

fréquence de résonance, ce qui est synonyme d’une modification de la viscoélasticité de la

surface. La même expérience a été réalisée sur une SLB de composition 100 % de POPC.

Lors de l’ajout du CFPS exprimant l’AH-eGFP, la relation entre la variation de dissipation et

la variation de fréquence est proportionnelle de 0 à -270 Hz. Puis, une cassure de la pente

apparait durant laquelle la dissipation varie moins vite que la fréquence de résonance. Ceci

indique que la viscoélasticité de la surface est modifiée signifiant que les protéines sont

incorporées dans la membrane.

En conclusion, la production d’AH-eGFP sur une SLB composée de 100% de POPC

ou de 68% d’extrait total d’E.coli / 32% POPC est identique. Ce résultat nous indique que la

composition lipidique d’une SLB ne semble pas avoir d’incidence sur l’incorporation des

protéines membranaires. Ceci est en accord avec les travaux de l’équipe de Swartz

sur

l’expression de protéines par un système d’expression acellulaire dans des liposomes. Il a

ainsi montré que l’insertion de protéines AqpZ dans des bicouches lipidiques (sous forme de

liposomes) de composition 75% PE / 25% PG (wt/wt) en comparaison à l’insertion de ces

protéines dans des liposomes comportant des molécules lipidiques DOPC, ne présentait pas

de différences.

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