3.4.1 Évaluation de la prolifération
La prolifération des cellules SaOS-2 a été évaluée par le MTT (3 — [4,5 — diméthylthiazol-2yl]-2,5 — diphényltétrazolium bromide) (MTT) (Sigma, St-Louis, MO, USA), soit un test permettant de mesurer directement l’activité métabolique (58,64,66,67). Des plaques à culture cellulaire à 12 puits ont été ensemencées à défaut de 5 X 104 cellules SaOS-2 par puits. Après une période d’acclimatation de 48 h, les cellules (en triples exemplaires) ont été exposées à des concentrations de CFC (0 %, 0.5 %, 1 %, 5 %, 10 % et 30 %) quotidiennement durant trois ou cinq jours. L’expérimentation a été séparée en trois volets :
1- Exposition au CFC durant 30 min quotidiennement 2- Exposition au CFC pendant 60 min quotidiennement 3- Exposition au CFC en tout temps
Les cellules ont été incubées à 37°C, 5 % de CO2 dans un milieu de culture frais jusqu’à l’exposition suivante, soit environ 24 h plus tard. Un délai de 24 h a été alloué à la suite de la dernière exposition avant de procéder au test colorimétrique. Au temps indiqué, 100 µl de solution de MTT à 5 mg/mL ont été ajoutés aux cultures qui ont ensuite été incubées durant 4 h à 37°C, 5 % de CO2, à l’obscurité. Le formazan formé par les cellules a été dissous par l’ajout de 500 µl, par puits, d’un tampon d’extraction (0.04 N chlorure d’hydrogène (HCL) dans de l’isopropanol). Les échantillons ont été centrifugés puis transférés en triplicata sur une plaque à 96 puits avant de procéder à la lecture de la densité optique par un spectrophotomètre (X-Mark microplate spectrophotometer, BioRad Laboratories, Mississauga, ON, Canada) à une longueur d’onde de 550 nm. Les résultats ont été rapportés sous forme de moyenne ± l’écart-type (ET).
3.4.2 Effet du CFC sur la mort cellulaire des OB
3.4.2.1 Effet du CFC sur l’expression du lactate déshydrogénase par les OB La lyse cellulaire/nécrose a été évaluée par le dosage des lactates déshydrogénases (LDH) dans les surnageants des cultures cellulaires.
Pour doser l’activité de la LDH, 5 X 105 cellules SaOS-2 dans 3 mL de milieu de culture ont été cultivées dans des puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits. Après une période d’acclimatation de 48 h, les cellules (en doubles exemplaires, excepté les contrôles qui étaient en triplicata) ont été exposées à des concentrations de CFC (0 %, 5 %, 10 % et 30 %) quotidiennement durant 24 ou 48 h. L’expérimentation a été séparée en deux volets : 1- Exposition au CFC pendant 60 min quotidiennement
2- Exposition au CFC en tout temps
Entre chaque exposition, les cellules ont été mises en contact avec du milieu de culture frais et incubées à 37°C, 5 % de CO2. Au temps indiqué, 1 mL du surnageant de chaque puits a été prélevé, excepté pour un des puits contrôle où l’extraction du maximum de LDH a eu lieu. L’ajout de 50 µl de tampon de lyse 10X (Promega, Madison, WI, USA) suivi d’une période d’incubation de 45 min à 37°C, 5 % de CO2 a permis de collecter 1 mL du surnageant de ce puits contrôle qui a été utilisé comme contrôle positif (CP). Le contrôle négatif (CN) correspond aux cellules non exposées au CFC. Le compte cellulaire de chaque puits a été effectué afin d’avoir une donnée de référence. Le dosage de la LDH a été réalisé grâce à la trousse Cyto Tox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI, USA) (68). Par la suite, 50 µl de chaque surnageant a été transféré en duplicata dans une plaque à 96 puits dans lesquels 50 µl d’un mélange de substrat (assay buffer + substrate mix) fourni par la compagnie a été ajouté. Les échantillons ont été incubés à l’obscurité, T° ambiante, durant 30 min. Afin d’arrêter la réaction, 50 µl d’une solution acide stop solution (Promega, Madison, WI, USA) a été ajoutée. La densité optique des échantillons a été lue par spectrophotomètre à une longueur d’onde de 490 nm. Afin de normaliser l’activité de la LDH selon le nombre de cellules présente dans l’échantillon, une règle de proportionnalité a été réalisée. L’absorbance de chaque échantillon est donné par rapport au même nombre de cellules, soit 1 000 000. Les résultats ont été rapportés sous forme de moyenne ± ET.
3.4.2.2 Effet du CFC sur l’apoptose des OB
Les cellules apoptotiques et nécrotiques ont été déterminées par un double marquage à l’annexine V-isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et à l’iodure de propidium (PI) (eBioscience, San Diego, CA, USA), soit des composés provoquant une fluorescence verte et/ou rouge de la cellule tout dépendant son état.
Une concentration cellulaire de 105 SaOS-2 dans 3 mL de milieu de culture a été cultivée dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits. Après une période d’acclimatation de 48 h, les cellules (en triples exemplaires) ont été exposées à des concentrations de CFC (0 %, 0.5 %, 1 %, 5 %, 10 % et 30 %) quotidiennement durant 24, 48 ou 96 h. L’expérimentation a été séparée en deux volets :
1- Exposition au CFC pendant 60 min quotidiennement 2- Exposition au CFC en tout temps
Entre chaque exposition, les cellules ont été mises en contact avec du milieu de culture frais et incubées à 37°C, 5 % de CO2. Au temps indiqué, elles ont été détachées par l’ajout de 600 µL 0.05 % trypsin-0.1% EDTA. Le compte cellulaire de chaque puits a été effectué afin de prélever le même nombre de cellules par échantillon pour les analyses. Suite à la centrifugation, chaque échantillon a été suspendu dans un tampon de liaison (BB1X) (eBioscience, San Diego, CA, USA) où 5 µL d’annexine V-FITC ont été ajoutés puis incubés durant 10 min à 37°C, 5 % de CO2 à l’obscurité. Après cette période, 10 µL de PI ont été ajoutés et les cellules ont été lavées au PBS. Les échantillons ont été conservés à l’obscurité dans 500 µL de paraformaldéhyde 2 % (Fisher Scientific, Québec, Canada) à 4°C. La lecture a été effectuée par un cytomètre en flux (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) analysant 10 000 évènements par échantillons. La détection de la fluorescence de l’annexine V-FITC s’effectuait à une longueur d’onde de 520 nm et celle de PI à 610 nm. Pour chaque expérimentation, des contrôles ont été utilisés selon le modèle suivant : 1) Un échantillon non coloré pour déterminer le niveau naturel de fluorescence des cellules 2) Un échantillon marqué à l’annexine V-FITC seulement 3) Un échantillon marqué à PI seulement 4) Un échantillon double marqué à l’annexine V-FITC et PI (37). Lorsque la population cellulaire était positive à l’annexine V-FITC et négative à PI les cellules étaient
V-FITC et positive à PI les cellules étaient considérées nécrotiques. Lorsque la population cellulaire était positive à l’annexine V-FITC et à PI les cellules étaient considérées apoptotiques et nécrotiques. Les résultats ont été rapportés sous forme de moyenne ± ET.
3.4.2.3 Effet du CFC sur l’expression de Bax et Bcl-2 par les OB
Afin de confirmer les résultats obtenus suite au double marquage à l’annexine V-FITC et à PI, l’expression des protéines spécifiques Bax et Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA) a été analysée par immunobuvardage de type western (western blot).
Pour détecter l’expression des gènes pro et anti-apoptotiques, 5 X 105 cellules SaOS-2 dans 3 mL de milieu de culture ont été cultivés dans des puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits. Après une période d’acclimatation de 48 h, les cellules (en doubles exemplaires) ont été exposées à des concentrations de CFC (0 %, 5 %, 10 % et 30 %) quotidiennement durant 24 ou 48 h. L’expérimentation a été séparée en deux volets :
1- Exposition au CFC pendant 60 min quotidiennement 2- Exposition au CFC en tout temps
Entre chaque exposition, les cellules ont été mises en contact avec du milieu de culture frais et incubées à 37°C, 5 % de CO2. Au temps indiqué, les cultures ont été préparées pour l’extraction des lysats cellulaires protéiques. Pour ce faire, les cellules ont été détachées des puits par l’ajout de 600 µL 0.05 % trypsin-0.1% EDTA. Le compte cellulaire de chaque puits a été effectué afin d’avoir une donnée de référence. Suite à la centrifugation, les cellules ont été lysées par l’ajout de 50 µL d’une solution de lyse contenant un tampon d’extraction 2X (25 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM de chlorure de sodium (NaCl), 1 mM EDTA), de l’eau apyrogène, du glycérol 10 %, du sodium dodécyl sulfate (SDS) 0.1 %, du Triton X-100 1 % et du déoxycholate de sodium (NaDe) 0.05 %. Les lysats ont été incubés durant 1 h, sous agitation, à 4°C puis centrifugés avant de procéder au dosage des surnageants par la technique de Bradford (69). Il s’agit d’une méthode d’analyse par spectroscopie permettant de mesurer la concentration de protéines dans une solution. Le réactif de Bradford (BioRad Laboratories, Mississauga, ON, Canada) est un colorant au bleu de coomassie dilué dans de l’éthanol rendant sa couleur brune. Au contact d’une protéine, le pH de la solution devient basique et tourne au bleu. Plus la concentration des
protéines est élevée plus la solution est bleu foncée. L’absorbance enregistrée est comparée aux standards de Bradford dont la concentration est connue afin de déterminer la concentration réelle de nos échantillons. Suite à ce dosage, une quantité équivalente a été prélevée dans chaque échantillon pour procéder à l’immunodétection de Bax, Bcl-2, et β-actine (Sigma-Aldrich, ON, Canada) soit la protéine agissant comme témoin de chargement.
La séparation de 20 µg de protéines a été réalisée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS et transférée par buvardage sur une membrane de nitrocellulose (37,58,67). Au préalable, chaque échantillon de protéines a été dénaturé par l’ajout de 10 µL de tampon de dénaturation 2X (4 % SDS, 5-10 % 2-mercaptoéthanol, 20 % glycérol, 125 mM Tris-Cl pH 6.8, bleu de bromophénol) suivi d’un chauffage à 95°C durant 5 min avant d’être refroidi à 4°C à l’aide d’un thermocycleur (MyCycler; Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). La totalité des protéines dénaturées a été transférée sur le gel d’électrophorèse à une concentration de 10 % d’acrylamide où la migration a eu lieu durant environ 75 min à 75-100 V. Suite à la migration, les protéines ont été transférées sur la membrane de polyvinylidene fluoride (PVDF) (Immobilon transfer membranes; Millipore, Etobicoke, ON, Canada) durant 60 min à 100 V. Avant de procéder à la détection des protéines spécifiques, la membrane a été bloquée avec une solution de lait en poudre 5 % dans du TBS 1X (0.05 M Tris-Cl pH 7.4 et 0.2 M NaCl) durant 60 min, sous agitation à T° ambiante. Les membranes ont ensuite été incubées sous agitation durant une nuit à 4°C en présence des anticorps primaires, anti-Bax, anti-Bcl-2 et anti-β-actine. Les dilutions des anticorps, dans une solution de TBS 1X et lait en poudre 1 %, figurent dans le tableau 4. Le lendemain, les membranes ont été lavées quatre fois pendant 10 min sous agitation avec une solution de TBS 1X et de polyoxyéthylène sorbitan monolaurate (Tween 20) 0.05 % (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada) après quoi elles ont été mises en contact pendant 60 min, à T° ambiante avec l’anticorps secondaire, soit un anti-souris couplé à la
horseradish peroxidase (HRP) (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA), dilué à 1 : 5 000 dans
du TBS 1X et lait en poudre 1 %. Une deuxième série de lavages de quatre fois 10 min sous agitation avec une solution de TBS 1X et de Tween 20 0.05 % a été effectuée. Les membranes ont ensuite été légèrement séchées puis mises en contact avec une solution de
(Chemiluminescent HRP substrate; Millipore, Billerica, MA, USA) durant 2 min, avant de détecter le signal par chimioluminescence (VersaDoc imaging system; BioRad Laboratories, Mississauga, ON, Canada). Des comparaisons qualitatives entre les résultats ont été réalisées.
TABLEAU 5 :INFORMATIONS SUR LES ANTICORPS UTILISÉS
Anticorps Espèces Dilution
Bax Souris 1 :200
Bcl-2 Souris 1 :200
β-actine Souris 1 :1000