D´ecoration des chaˆınes

Les chaˆınes magn´etiques pr´esent´ees pr´ec´edemment constituent de nouveaux mat´eriaux. Leur fonctionnalisation les rend int´eressantes pour un grand nombre d’applications telles que l’analyse, l’isolation et/ou la pr´eparation d’esp`eces.

2.4.1

Couches de poly´electrolytes

Si le polym`ere, adsorb´e sur les particules, est un poly´electrolyte, on peut changer `a fa¸con la charge de la chaˆıne magn´etique : un poly´electrolyte de charge oppos´ee va alors se fixer sur la chaˆıne en effectuant une “inversion de charge”. On peut ainsi faire des d´epˆots couche par couche [Decher, 1997] et ce faisant, fonctionnaliser des surfaces.

90 2.4. D´ECORATION DES CHAˆINES A B 400 300 200 100 0

Nombre de protéines par par

ticule 25 20 15 10 5 0

Distance entre particules (nm)

l=10 nm l=20 nm l=30 nm l=40nm l h a α x x N =4a l-h

Soit l = 2x + h avec x = a (1 - cos α) pour avoir un lien unique, il faut qu'il y ait un seul lien sur la calotte sphérique (grisée) d'aire 2 π a2 (1 - cos α)

Soit N protéines par particule:

Ce qui donne :

N =4π a

2

π a (l-h)

Fig. 2.30 – A : calcul du nombre N de prot´eines par particule afin d’obtenir un lien unique en fonction de la distance h entre particules (bord `a bord) ; B : variation du nombre de prot´eines par particule afin d’obtenir un lien unique en fonction de la distance entre particules. Variations calcul´ees pour diff´erentes longueur l de lien (rayon a des particules pris ´egal `a 375 nm).

Ainsi, lorsque l’on forme des chaˆınes permanentes avec du PAA dans un ca- pillaire13_{, on peut ensuite introduire un polycation comme par exemple la poly-}

L-lysine (pKA '10.2). L’utilisant de poly-L-lysine fluorescente permet d’obser-

ver sa fixation sur des chaˆınes permanentes obtenues avec du PAA (Fig.2.31). L’introduction de la poly-L-lysine peut se faire par capillarit´e ou via un champ ´electrique.

La poly-L-lysine est couramment utilis´ee en biologie pour fixer des objets sur des lames de verre (puce `a ADN g´enomique par exemple). On peut alors imaginer l’utiliser pour fixer de l’ADN sur nos chaˆınes. En ajoutant de l’ADN `a la suspension de chaˆınes, celui-ci se fixe en certains points de leur surface. La concentration d’ADN sur les chaˆınes peut ˆetre vari´ee grandement en jouant sur sa concentration et sur sa taille. Dans la Fig.2.35, peu (une en moyenne) de mol´ecules

13_{Il est pr´ef´erable d’introduire la poly-L-lysine lorsque les chaˆınes sont organis´ees dans un}

CHAPITRE 2. AUTO-ASSEMBLAGES IRR´EVERSIBLES LIN´EAIRES 91

A

B

Fig. 2.31 – A : chaˆınes magn´etiques permanentes obtenues avec du PAA (´emulsion V2G, Ademtech) avant introduction de poly-L-lysine. B : visualisation de la poly-L- lysine-FITC introduite `a l’aide d’un champ ´electrique. L’observation est effectu´ee en ´epifluorescence sur un microscope Zeiss Axiovert 100 ´equip´e d’une lampe `a mercure pour l’excitation et d’un objectif 100X. La source au mercure est filtr´ee `a λ= 450- 490 nm et l’observation se fait `a λ= 510-550 nm. Clich´es C.G.

d’ADN de grande taille (phage λ, 48.5 kpb) est fix´ee par chaˆıne. Fig.2.33 la chaˆıne est enti`erement recouverte d’ADN courts (m´elange ”PhiX174”).

20 µm

Fig. 2.32 – Mol´ecules d’ADN de phage λ, marqu´ees avec l’intercalant YOYO-1, fix´ees sur des chaˆınes permanentes obtenues avec du PAA puis recouvertes de poly-L-lysine. L’observation est ef- fectu´ee dans les mˆemes conditions que pour la Fig.4.1. Clich´e C.G.

2.4.2

D´ecoration par couplage covalent

Les chaˆınes, obtenues par collage magn´eto-stimul´e de particules recouvertes de PAA, portent des fonctions COOH provenant de ce dernier. Ces groupes peuvent servir `a greffer des prot´eines, via leurs fonctions NH2, sur les chaˆınes

92 2.4. D´ECORATION DES CHAˆINES

Fig. 2.33 – Chaˆıne (obtenue avec du PAA puis re- couverte de poly-L-lysine) recouverte d’un m´elange d’ADN courts de type ”PhiX174” marqu´es avec l’in- tercalant YOYO-1. L’observation est effectu´ee dans les mˆemes conditions que pour la Fig.4.1. Clich´e C.G.

20 µm

[Hermanson, 1996] [Williams and Ibrahim, 1981]. La difficult´e de ce type de gref- fage est de conserver des chaˆınes uniques, non enchevˆetr´ees et non coupl´ees. Le champ magn´etique utilis´e doit alors ˆetre faible (∼10 mT).

Greffage d’anticorps On a ainsi greff´e des IgG de souris anti-CD3. Ce sont des anticorps dirig´es contre les lymphocytes T (CD3+). Afin de r´ev´eler le greffage, on utilise des anticorps secondaires fluorescents (anti-souris Alexa 488 IgG) dirig´es sp´ecifiquement contre ceux greff´es (Fig.34).

Le protocole de greffage et les ´etudes concernant la sp´ecificit´e de l’anticorps secondaire, la stabilit´e du greffage, le dosage des anticorps greff´es et la minimi- sation des interactions non-sp´ecifiques sont pr´esent´es en Annexe 2.

En r´esum´e, on montre (i) que l’on peut greffer 1/6`eme _{de monocouche, sans}

optimisation du protocole, (ii) que le greffage reste stable au moins une semaine et (iii) qu’il est pr´ef´erable d’utiliser une solution de BSA 0.5% en masse pour laver les chaˆınes une fois greff´ees afin de diminuer les interactions non-sp´ecifiques.

Ce travail a ´et´e l’objet du stage de 3`eme _{ann´ee de l’ESPCI de Florence Thi-}

villiers.

Fig. 2.34 – Filament constitu´e de parti- cules magn´etiques (Adembeads, diam`etre 0.75µm) recouvertes de PAA, greff´e avec un IgG de souris anti-CD3. Il est marqu´e avec de l’anti-souris IgG Alexa 488. L’ob- servation est effectu´ee en ´epifluorescence sur un microscope Nikon Eclipse TE 300 ´equip´e d’une lampe `a mercure pour l’ex- citation et d’un objectif 100×. La source au mercure est filtr´ee `a λ= 450-490 nm et l’observation se fait `a λ= 510-550 nm. Clich´e C.G.

CHAPITRE 2. AUTO-ASSEMBLAGES IRR´EVERSIBLES LIN´EAIRES 93 Le chapitre 4 de cette th`ese illustre l’utilisation de tels filaments comme ma- trice de s´eparation pour le tri de cellules rares en microcanaux.

Greffage d’enzyme Nous avons aussi montr´e qu’il est possible de greffer de la trypsine sur des chaˆınes permanentes.

La trypsine est une enzyme qui hydrolyse les liaisons peptidiques. Elle est uti- lis´ee pour obtenir un extrait peptidique des prot´eines permettant leur identifica- tion sur la base de banques de donn´ees g´enomiques et prot´eomiques. Cette enzyme est particuli`erement int´eressante car les sites de coupure du cot´e C-terminal des lysine et arginine sont assez fr´equents, ce qui conduit `a une digestion homog`ene de la prot´eine et `a l’obtention de fragments de taille adapt´ee `a la gamme de masse des spectrom`etres de masse utilis´es.

Nous avons mesur´e l’activit´e de l’enzyme afin de v´erifier l’efficacit´e du gref- fage. Pour ce faire, nous avons fait r´eagir l’enzyme avec un substrat (BAPNA ou Benzoyl- L Arginine- Para NitroAniline) qui lib`ere une mol´ecule color´ee (p-nitroaniline) dont on mesure la concentration avec un spectrophotom`etre (λ=405 nm). Les tests effectu´es (voir Annexe 2) mettent en ´evidence (i) qu’il

R STUV W XY Z [\ ] \ [ ^ _`^ ] a b [ ^ \ [ ^ [ ^ ] [^ \ [ ^ _`^ ] a b \ [ ^ [ ^ ] [^ \^ [^ ] [\ ] cde[d U f X Wg ShiX WjW XY _k ilXY a

Fig. 2.35 – R´eaction de do- sage de l’activit´e de la tryp- sine par utilisation d’un sub- strat (BAPNA) qui lib`ere une mol´ecule color´ee (jaune).

est pr´ef´erable de greffer la tryspine en pr´esence de NP10 0.1% en masse ou de Triton X405 0.3% en masse (ii) qu’il a ´et´e possible de greffer de la trypsine sur des chaˆınes permanentes mais qu’elles se sont emmˆel´ees et que beaucoup d’entre elles ont ´et´e perdues lors des diff´erents lavages. Nous n’avons fait que montrer la faisabilit´e du greffage et nous n’avons pas chercher `a l’optimiser.

Ce travail a ´et´e effectu´e en collaboration avec Zuzana Bilkova14_{, lors de son}

stage post-doctoral `a l’Institut Curie dans le Laboratoire Macromol´ecules et Mi- crosyst`emes pour la Biologie et la M´edecine.