T ECHNIQUES DE MICROSCOPIE

a) Immunomarquages et microscopie optique

i. Immunomarquages

Cette technique est utilisée pour déterminer la localisation subcellulaire d’une protéine. Un anticorps couplé à un fluorochrome est dirigé contre la molécule d’intérêt et, grâce à l’émission de fluorescence, il est possible de la localiser à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Sur une plaque chauffante à 37°C, après avoir été lavées 3 fois dans du Locke N, les cellules vivantes sont incubées dans du Locke N pour la condition repos ou dans une solution de nicotine de 20 µM pour la condition stimulée. Les cellules transfectées sont elles, stimulées avec une solution de KCl 59 mM. Si un marquage extracellulaire est réalisé, les cellules sont incubées en présence des anticorps pendant 10 minutes puis lavées rapidement avec du Locke N avant d’être fixées dans du PBS (20 mM K2HPO4, 4,95 mM KH2PO4, 0,9%

NaCl, pH 7,5), contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) à température ambiante. Quand un

131 marquage intracellulaire est réalisé, les cellules sont perméabilisées 10 minutes dans du PBS contenant 4% de PFA et 0,1% de Triton X-100. Après 6 lavages de 5 minutes dans du PBS, les cellules sont saturées 2 heures à 37°C ou une nuit à 4°C dans une solution de PBS contenant 3% de BSA et 10% de sérum de chèvre. Après 6 lavages avec du PBS, les cellules sont incubées une heure à 37°C avec les anticorps secondaires couplés aux différents fluorochromes (Alexa-488, Alexa-555 ou Alexa-647). Les lamelles sont ensuite lavées 6 fois 5 minutes puis les filaments d’actine peuvent être révélés grâce à la phalloïdine-TRITC (tétraméthylrhodamine B isothiocyanate) (Sigma) diluée 2000 fois, en incubant les cellules 20 minutes à l’obscurité. Les cellules sont ensuite lavées 6 fois 5 minutes dans du PBS, rapidement rincées à l’eau, séchées puis montées sur une lame dans un milieu de montage adapté à l’observation en microscopie confocale, le milieu Elvanol-Mowiol (Mowiol 4-88, France Biochem 85).

ii. Microscopie confocale

Les lamelles sont observées avec le microscope confocal à balayage laser (Leica TCS SP5 II). Ce microscope optique permet d’effectuer des coupes virtuelles jusqu’à 0,2 µm d’épaisseur dans l’échantillon observé et enregistre uniquement la fluorescence émise dans un plan. La fluorescence parasite des plans focaux supérieurs et inférieurs est donc éliminée.

Après acquisition des images, une analyse semi-quantitative de la fluorescence a été réalisée avec le logiciel Icy. Afin de pouvoir comparer différentes conditions, toutes les images ont été acquises avec les mêmes paramètres. Pour quantifier les marquages extracellulaires, la quantité moyenne de la fluorescence normalisée par la surface (correspond à la périphérie cellulaire) a été déterminée pour chaque cellule. L’intensité moyenne d’un marquage est ensuite comparée pour chaque condition.

b) Feuillets membranaires, microscopie électronique et analyses statistiques

Cette technique permet de visualiser à l’échelle ultrastructurale la face interne ou externe de la membrane plasmique d’une cellule ainsi que les organites et molécules qui y sont rattachés. Elle permet notamment d’observer l’organisation latérale de la membrane en nanodomaines et en microdomaines lipidiques. De plus, des analyses statistiques

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permettent de quantifier la formation d’agrégats de molécules et de déterminer avec précision des colocalisations.

i. Préparation des feuillets de membrane plasmique et observation en microscopie électronique à transmission.

Pour la préparation de feuillets de membrane plasmique, des grilles de microscopie électronique en nickel recouvertes de Formvar et fixées sur des lamelles de verre sont appliquées sur des cellules chromaffines mises en culture sur des lamelles de verre recouvertes de fibronectine. Ces cellules sont préalablement stimulées ou non avec une solution de nicotine de 20 μM. Lorsque l’expérience le requiert, des marquages sont réalisés pendant la stimulation. Une forte pression est ensuite appliquée sur les grilles à l’aide d’un bouchon de liège pendant 25 secondes. Les grilles sont ensuite retirées, arrachant des fragments de la membrane plasmique des cellules qui y adhèrent. Des feuillets de membrane plasmique dont la face cytoplasmique se trouve vers le haut sont ainsi obtenus.

L’ensemble du processus est réalisé en moins de 30 secondes. Les feuillets sont ensuite fixés dans 2% de PFA pendant 10 minutes à 4°C. Après saturation des sites aspécifiques avec du PBS contenant 0,5% de BSA, 0,5% de BSA acétylée, des immunomarquages sont réalisés avec des anticorps secondaires ou avec la streptavidine, couplés à des billes d’or colloïdal de différentes tailles. Après fixation au glutaraldéhyde 2,5% dans du PBS, les échantillons sont post-fixés avec 1% de tétroxyde d’osmium (OsO4), déshydratés à l’éthanol par plusieurs bains de degrés alcooliques croissants, traités à l’hexaméthyldisilazane et séchés à l’air. Les observations sont réalisées grâce à un microscope électronique à transmission Hitachi 7500.

Pour chaque condition, environ 50 images correspondant à 50 μm2 de membrane plasmique ont été analysées (Wilson et al., 2004). Les granules arrimés ont été comptés aléatoirement sur ces zones de 50 µm² de feuillets de membrane plasmique (25<n<50).

ii. Analyse statistique de la distribution des marquages par la fonction K de Ripley

Les images numériques des feuillets de membrane plasmique marqués ont été traitées pour éliminer le bruit de fond, et les coordonnées (x, y) de toutes les particules d’or ont été déterminées grâce à un plug-in du logiciel Image J.

133 La fonction K univariée de Ripley utilise ces coordonnées pour déterminer si les billes d’or sont organisées en agrégats, dispersées ou réparties aléatoirement. La fonction K(r) est définie comme suit : K(r) = N(r)/λ ou N(r) est le nombre de voisins à une distance inférieure à r, et λ est l’intensité du nuage de points, c’est à dire le nombre de points par unité de surface. Pour une distribution aléatoire, on a K(r) = πr2, alors que si K(r) > πr2, les particules ont plus de voisins que prévu par la distribution aléatoire c’est à dire qu’elles forment des agrégats. La fonction peut être linéarisée et on définit L(r) = √(K(r)/π) avec un intervalle de confiance de 99% ± 1. Dans ces conditions, -1 < L(r) – r < 1 si la distribution est aléatoire, et L(r) – r > 1 si les particules forment des agrégats.

Une modification de cette fonction en une fonction bivariée permet de définir les relations spatiales de particules d’or de deux tailles différentes, et donc de déterminer la colocalisation de deux protéines en analysant la formation d’agrégats regroupant les deux types de billes. Dans ce cas, la fonction Kbiv(r) tient compte des distances entre les grosses billes et chacune des petites billes, et inversement. On définit comme précédemment la fonction linéarisée Lbiv(r), avec un intervalle de confiance de 95% ± 1. Si -1 < Lbiv(r) – r < 1, les billes ne sont pas colocalisées, alors qu’elles le sont pour Lbiv(r) – r > 1.

Pour ces deux types d’études (existence d’agrégats et étude de colocalisation), une macro Excel écrite sous Visual Basic nous a été généreusement fournie par JF Hancock (Prior et al., 2003).