Z OOM SUR LE RÔLE DU CYTOSQUELETTE AU COURS DE L ’ EXOCYTOSE

Les mécanismes moléculaires qui régissent l’exocytose régulée sont très complexes et impliquent une multitude d’interactions entre différentes protéines. La régulation fine et précise de ces interactions est donc cruciale pour permettre le bon déroulement de chaque étape de l’exocytose et nécessite une coopération étroite avec les éléments du cytosquelette.

a) Présentation du cytosquelette

Le cytosquelette cellulaire est composé de 3 éléments : les filaments intermédiaires, les microtubules et l’actine (Figure 11, A). Les filaments intermédiaires sont des structures fibrillaires exprimées de façon hétérogène dans les différents types cellulaires. Ce sont les éléments les plus stables du cytosquelette, qui permettent de maintenir la forme de la cellule et d’ancrer les organites cellulaires. Les microtubules sont des fibres creuses, composées d’une protéine globulaire, la tubuline. Ces structures dynamiques alternent entre des phases de polymérisation et de dépolymérisation, ce qui leur permet de jouer un rôle dans le déplacement des vésicules ou des organites et lors de la migration des chromosomes au cours de la mitose. Enfin, l’actine existe sous forme monomérique (actine-G) ou filamenteuse (actine-F). L’association de monomères d’actine engendre la formation de filaments qui peuvent alors s’assembler en faisceaux d’actine. Le cytosquelette d’actine intervient notamment dans les processus de remodelage membranaire et de mobilité cellulaire.

Selon les processus dans lesquels ils sont impliqués, les filaments d’actine vont s’organiser de différentes manières dans les cellules (Figure 11, B). Les filaments peuvent être organisés en faisceaux parallèles serrés, comme dans les microvillosités des cellules intestinales ou dans les filopodes, projections cytoplasmiques retrouvées sur le bord des cellules en migration. L’actine peut également former des faisceaux contractiles dans les cellules musculaires ou au niveau de l’anneau contractile qui sépare deux cellules en division. Au cours de l’internalisation de vésicules, elle permet également de faciliter le processus de scission. Au niveau des points d’adhésion à la matrice extracellulaire, les faisceaux contractiles forment des fibres de stress. C’est grâce à des moteurs moléculaires

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Figure 12 : Rôle du cytosquelette dans le transport des granules de sécrétion.

Après leur synthèse au niveau du TGN, les granules de sécrétion sont acheminés vers la périphérie cellulaire le long des microtubules, via les kinésines. Ils sont ensuite transférés vers le cytosquelette d’actine cortical où les myosines II et Va contrôlent et restreignent leur mobilité.

Espace intracellulaire

Espace extracellulaire

Actine corticale

Kinésine

Transport des granules le long des microtubules

Capture des granules dans le réseau d’actine cortical

Myosine Va Myosine II

31 comme les myosines que la contraction de ces fibres génère une force de tension qui permet à la cellule de moduler ses interactions avec la matrice extracellulaire lors des processus d’adhérence et de migration. Le réseau d’actine peut également s’organiser en maille, comme dans les lamellipodes ou dans le réseau d’actine cortical sous-membranaire.

La polymérisation du cytosquelette d’actine permet de réguler les déplacements et les mouvements cytoplasmiques des granules de sécrétion et des endosomes.

Dans les prochains paragraphes, je m’intéresserai aux deux éléments du cytosquelette qui entrent en jeu au cours du processus d’exocytose, à savoir les microtubules et le réseau d’actine, qui participent au transport des granules de sécrétion et à leur capture dans le réseau cortical. J’aborderai ensuite la dynamique du cytosquelette d’actine au niveau du site d’exocytose.

b) Rôle du cytosquelette dans l’exocytose

Dans les cellules chromaffines, le cytosquelette d’actine est principalement distribué à la périphérie cellulaire. Les microtubules sont également présents à la périphérie mais forment un réseau moins dense : ils sont essentiellement localisés dans le cytoplasme (Trifaro et al., 2008).

i. Transport des granules de sécrétion

Après leur synthèse au niveau du TGN, les granules de sécrétion doivent être acheminés à la membrane plasmique. Leur transport le long des structures du cytosquelette est assuré par des moteurs moléculaires de transport : les kinésines pour les microtubules et les myosines pour les filaments d’actine (Brown, 1999). L’utilisation de différentes drogues a permis de mettre en évidence le rôle de ces structures (Neco et al., 2003). Les drogues agissant sur les microtubules affectent uniquement le transport péri-nucléaire des granules de sécrétion, sans affecter leur mobilité corticale, et ont un impact mineur sur la sécrétion.

Ces observations suggèrent que les microtubules jouent un rôle dans le transport des vésicules entre l’appareil de Golgi et la périphérie cellulaire (Figure 12) (Rudolf et al., 2001).

Lorsque les vésicules arrivent à la périphérie cellulaire, un transfert s’effectue des microtubules vers les filaments d’actine, nécessitant la coopération entre les différents moteurs moléculaires (DePina et Langford, 1999, Desnos et al., 2007a). Cette coordination

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entre les microtubules et les filaments d’actine est indispensable au bon déroulement du processus d’exocytose (Neco et al., 2003).

Des moteurs moléculaires comme les myosines sont capables de contrôler et d’influencer la dynamique du cytosquelette d’actine. Deux classes de myosines présentes dans les cellules chromaffines y participent : les myosines II et Va (Neco et al., 2002). La myosine II est présente à la périphérie cellulaire et colocalise avec l’actine corticale alors que la myosine Va est associée aux granules de sécrétion dans le cytoplasme (Rose et al., 2003, Desnos et al., 2007b). La myosine II participe ainsi au mouvement des granules et régule leur accès à la membrane plasmique. L’expression d’un mutant inactif de la myosine II (Neco et al., 2004) et la présence d’inhibiteurs de la myosine II (Neco et al., 2002) restreignent le mouvement des granules de sécrétion dans le réseau d’actine cortical. Certaines protéines présentes sur les granules de sécrétion, telles que Rab27 et MyRIP, interagissent avec à la myosine Va pour contrôler les interactions granules/actine (Desnos et al., 2003). En se déplaçant sur les filaments d’actine, la myosine Va régule la distribution et le mouvement des granules de sécrétion au sein du cytosquelette d’actine cortical (Rudolf et al., 2003, Desnos et al., 2007b). Elle est également impliquée dans le transport des granules le long des filaments d’actine entre le pool de réserve et la membrane plasmique (Rose et al., 2003).

ii. La barrière d’actine corticale

Dans les cellules chromaffines, un dense réseau d’actine est présent en continuité à la périphérie cellulaire. Il forme une barrière physique empêchant les granules d’accéder à la membrane plasmique (Aunis et Bader, 1988). La fodrine est impliquée dans la structuration du cytosquelette d’actine (Perrin et Aunis, 1985). Cette protéine est capable de relier plusieurs filaments d’actine entre eux lorsque la concentration de calcium est faible. La protéine MARCKS participe elle aussi au maintien de cette barrière en rapprochant les filaments d’actine (Hartwig et al., 1992). Au cours du processus de sécrétion, la barrière du cytosquelette d’actine va subir une réorganisation dynamique. En effet, pour qu’il y ait exocytose, il faut que les granules de sécrétion accèdent à la membrane plasmique. Des marquages immunocytochimiques, à l’aide de la phalloïdine couplée à la rhodamine, ont permis de mettre en évidence qu’après une stimulation nicotinique, le cytosquelette d’actine est rapidement désassemblé pour permettre aux granules d’accéder aux sites

33 Figure 13 : Réorganisation du cytosquelette d’actine au cours du processus d’exocytose.

Dans les cellules au repos les granules ne peuvent pas accéder à la membrane plasmique car ils sont retenus dans une dense barrière d’actine. Son maintien est assuré par des protéines telles que la fodrine ou MARCKS, capables de resserrer les filaments d’actine entre eux. Lors d’une stimulation, l’entrée de calcium induit l’activation de la scindérine capable de cliver les filaments d’actine et de dissocier le réseau. Des nouveaux filaments d’actine sont également synthétisés au niveau du granule arrimé,viales complexes Cd42-WASP-Arp2/3 et Rab27A-MyRIP-myosine Va, afin de contribuer à la structuration du site d’exocytose et au processus de fusion.

Arrimage et amorçage Repos

scindérine

N-WASP

Complexe SNARE Fodrine MARCKS

P

P Espace intracellulaire

Espace extracellulaire

Arp2/3

Ca²⁺

Cdc42

Fusion

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d’arrimage (Cheek et Burgoyne, 1986). Cette réorganisation est contrôlée par la concentration de calcium intracellulaire et par diverses protéines interagissant avec le réseau d’actine comme par exemple la scindérine (Rodriguez Del Castillo et al., 1990).

Localisée à la périphérie des cellules neuroendocrines, la scindérine forme des agrégats au niveau de l’actine-F, qu’elle clive en petits fragments lors d’une stimulation (Vitale et al., 1991). L’entrée de calcium provoque aussi la dissociation de la fodrine des filaments d’actine. Parallèlement, MARCKS est phosphorylée par la protéine kinase C (PKC), ce qui la rend incapable de lier les filaments d’actine et participe à la dissociation du réseau cortical d’actine.

iii. Dynamique du cytosquelette d’actine au niveau du site d’exocytose

Longtemps le rôle de "barrière" a été le seul considéré pour le cytosquelette d’actine au cours de l’exocytose mais, depuis quelques années, de plus en plus d’études ont mis en évidence un rôle actif de l’actine au cours de ce processus (Gutierrez, 2012). En effet, lors d’une stimulation, parallèlement à la dépolymérisation du cytosquelette d’actine cortical, de nouveaux filaments d’actine sont également formés au niveau des sites d’exocytose pour permettre une sécrétion plus efficace. Des acteurs comme Rac1 et Cdc42 de la famille des Rho GTPases sont impliqués dans cette néosynthèse. L’expression de mutants constitutivement actifs (liés au GTP) de Rac1 (Rac1L61) ou de Cdc42 (Cdc42L61) induit une augmentation de la sécrétion neuroendocrine (Li et al., 2003, Gasman et al., 2004) et l’expression du mutant constitutivement actif de Cdc42 augmente également la quantité d’actine polymérisée à la périphérie cellulaire. Dans les cellules au repos, Cdc42 est membranaire alors que son partenaire, N-WASP, est cytosolique et qu’Arp2/3 est associée aux granules de sécrétion. Le déclenchement du processus d’exocytose active Cdc42, qui recrute alors N-WASP à la membrane plasmique. Les granules de sécrétion s’arrimant à cet endroit, Arp2/3 s’associe avec ses effecteurs. Ce complexe agit alors comme site de nucléation pour former des nouveaux filaments d’actine au niveau des sites actifs d’exocytose (Gasman et al., 2004). D’autres acteurs comme Rab27 et MyRIP, capables d’affecter la dynamique du cytosquelette d’actine, jouent également un rôle dans ce processus (Figure 13) (Desnos et al., 2003).

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Role for membrane remodeling in cell death: Implication for health and disease

The Role of Lipids in Retrovirus Replication

Figure 13 : Structure des microdomaines lipidiques du TGN.

Les domaines lipidiques sont enrichis en cholestérol et glycolipides, Domaine lipidique

cholestérol protéine transmembranaire

Protéine à ancrage GPI lectines

glycolipides cytosol

lumière

Figure 14 : Structure des microdomaines lipidiques.

Au sein de la membrane plasmique, les domaines lipidiques sont enrichis en cholestérol (1) et en glycolipides (2) mais également en protéines transmembranaires (3) et à ancrage GPI (4) qui subissent des modifications par glycosylation (5).

Source : http://www.ulisboa.pt/wp-content/uploads/Clipping/Atomium-Culture.pdf

Espace exracellulaire

c

Domaine lipidique 3

c

1 2

4 5

Espace intracellulaire

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Le rôle précis de ces filaments néoformés n’est pas clairement établi : ils pourraient permettre une délimitation spatiale du site d’arrimage pour rendre ce processus plus efficace et/ou générer une force de compression sur les granules et contribuer à la délivrance de leur contenu (Neco et al., 2004). Une autre hypothèse serait l’implication de ces nouveaux filaments d’actine dans la régulation des deux modes de fusion (cavicapture/fusion totale) et/ou dans le couplage entre l’exocytose et l’endocytose (Jeng et Welch, 2001, Malacombe et al., 2006).