CHAPITRE 2 M ATERIEL ET METHODES
2.2 E XPRESSION DE L ’ARN POLYMERASE EN CELLULES D ’ INSECTE
HETEROTRIMERE TRONQUE (PA-PB1-PB2NTER) ... 44 PACTER-PB1∆CTER ... 44 PURIFICATION DES CONSTRUCTIONS EN PRESENCE D’ARN ... 45 FRACTIONNEMENT CYTOPLASMIQUE / NUCLEAIRE ... 45
2.4 WESTERN BLOT... 46
2.5 PRODUCTION D’ARNV PAR TRANSCRIPTION IN VITRO... 46
TRANSCRIPTION IN VITRO PAR LA T7 POLYMERASE ... 47 2.5.1.A CONCEPTION DES MATRICES ADN POUR LA TRANSCRIPTION IN VITRO ... 47 2.5.1.B REACTION DE TRANSCRIPTION IN VITRO ... 47 PURIFICATION DE L’ARN PRODUIT SUR GEL DENATURANT ... 48
2.6 DIFFUSION DE LUMIERE LASER A ANGLES MULTIPLES ET REFRACTOMETRIE (SEC-
MALLS-RI) ... 50
2.7 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE ... 50 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE EN COLORATION NEGATIVE ... 50 2.7.1.A PREPARATION DES ECHANTILLONS ... 50 2.7.1.B ACQUISITION ET TRAITEMENT DES IMAGES ... 50 CRYO-MICROSCOPIE ELECTRONIQUE ... 50 2.7.2.A PREPARATION DES ECHANTILLONS ... 50 2.7.2.B ACQUISITION ET TRAITEMENT DES IMAGES ... 50 2.7.2.C METHODE GRAFIX ... 50
2.8 TEST DE STABILITÉ THERMIQUE :TSA(THERMAL SHIFT ASSAY) ... 51
2.9 DIFFUSION DES RAYONS-X AUX PETITS ANGLES (SAXS) ... 51
2.10 CRISTALLOGRAPHIE RAYONS-X ... 52 2.11 ACTIVITE ENDONUCLEASE ... 52
2.12 ACTIVITE DE SYNTHESE D’ARN ... 52
2.13 MESURES DES AFFINITES ARN-POLYMERASE:ARN ... 52
ANISOTROPIE DE FLUORESCENCE ... 52 FILTER BINDING ASSAY (MESURE DES AFFINITES SUR FILTRE) ... 53
2.14 MICROSCOPIE RAYONS-X ... 54 PREPARATION DES ECHANTILLONS POUR LA MICROSCOPIE RAYONS-X ... 54 EXPERIENCE DE MICROSCOPIE RAYONS-X ... 55
Les travaux conduits par le laboratoire portent sur deux souches : - Souche A/Victoria/3/1975 (H3N2)
CHAPITRE2| 2.1STRATEGIE DE CLONAGE DE L’ARN-POLYMERASE POUR LE SYSTEME D’EXPRESSION EN BACULOVIRUS
MATERIEL ET METHODES
Les gènes codant pour chaque sous-unité de l’ARN-polymérase employés pour cette étude, sont des gènes synthétiques optimisés pour l’expression en cellules d’insecte.
2.1 STRATEGIE DE CLONAGE DE L’ARN-POLYMERASE POUR LE SYSTEME
D’EXPRESSION EN BACULOVIRUS
Différentes constructions de l’ARN-polymérase ont été réalisées. Chaque baculovirus recombinant codant pour une construction de l’ARN-polymérase a été réalisé au laboratoire suivant le protocole décrit dans Trowitzsch et al., 2010 et Garzoni et al., 2012 (Figure 25).
Les gènes codant pour chaque sous-unité sont combinés en un seul gène de fusion. Les gènes qui codent pour les sous-unités sont séparés par des liens du type GSGSG(ENLYFQG)AGSGSGSG avec, en leur centre (en gras) la séquence codant pour un site de clivage à la protéase TEV.
Le gène de fusion est cloné dans le vecteur pBac (Imre Berger, EMBL Grenoble) dans une cassette de clonage entre le gène codant pour la protéase TEV et celui codant pour une protéine rapporteur de l’expression protéique : la CFP (Cyan Fluorescent Protein, λexcitation = 430 nm et λémission = 450 – 550 nm).
Les bactéries DH10EMBacY (Imre Berger, EMBL Grenoble) sont transformées avec le plasmide pBac recombinant. Elles contiennent le matériel génétique du baculovirus (EMBacY). Le pBac contenant le gène de fusion est intégré à l’ADN du baculovirus EMBacY via une transposition Tn7. Les clones positifs sont identifiés par une sélection blanc/bleu et validés par un nouvel isolement sur boite LB agar Kanamycin / Tetracycline / Gentamycin / IPTG / BluOGal.
CHAPITRE2| 2.1STRATEGIE DE CLONAGE DE L’ARN-POLYMERASE POUR LE SYSTEME D’EXPRESSION EN BACULOVIRUS
MATERIEL ET METHODES
Figure 25 : Procédures standards d’expression en cellules d’insectes. Le plasmide pBac contenant le gène de fusion codant pour
l’ARN-polymérase est intégré dans l’ADN du baculovirus EMBacY par transposition Tn7. Les clones positifs sont identifiés par une sélection blanc / bleu. L’ADN EMBacY recombinant est purifié (Bacmid isolation) et utilisé pour transfecter des cellules d’insecte (Transfection) en plaques six puits. Deux clones pour chaque construction sont manipulés en parallèle et en duplicata (1, 1’ et 2, 2’). Un puit avec des cellules non-infectées (C) et un autre avec du milieu sans cellule (M) sont utilisés comme contrôle. Le baculovirus primaire (V0) est collecté et amplifié (Production of V1). Une analyse qualitative (Expression analysis, qualitative) du baculovirus primaire peut être réalisée par mesure du signal YFP et par Western Blot avec des anticorps spécifiques sur les cellules d’insecte ayant servi à sa production. 48 h après arrêt de la division cellulaire, le baculovirus amplifié (V1) est récolté par centrifugation douce, les cellules sont resuspendues dans du milieu frais et le signal de YFP et de CFP est suivi jusqu’à obtention d’un plateau. La production d’ARN-polymérase est ensuite analysée sur gel de polyacrylamide et permet la validation du baculovirus qui sera utilisé pour l’expression à grande échelle. Des stocks de cellules d’insecte infectées par le baculovirus peuvent être préparés pour un stockage à long-terme des baculovirus (TIPS/BIIC) (Garzoni et al., 2012). Après 3 jours, l’ADN EMBacY recombinant est purifié à partir d’une culture de 2 mL inoculée avec une seule colonie positive et utilisé pour transfecter des cellules d’insecte Spodoptera frugiperda (Sf21) adhérentes en plaques six puits cultivées en milieu Express Five SFM (Gibco, Life Technologies). 48 à 60 h après transfection, le milieu contenant le baculovirus virus primaire (V0) produit est collecté et utilisé pour infecter une culture de 25 mL de Sf21 en Erlenmeyer : il s’agit de l’étape d’amplification du V0 qui permet de produire une seconde génération de virus (V1) à partir du (V0). L’ADN du baculovirus EMBacY présente un gène rapporteur codant pour une protéine fluorescente, la YFP (Yellow Fluorescent Protein, λexcitation = 488 et λémission = 515 - 550), dont le signal est le témoin de la prolifération du baculovirus. Du
milieu frais est ajouté aux puits de la plaque et, deux jours plus tard, une première analyse qualitative de la production de protéines peut être effectuée après récolte des cellules, par mesure du signal de la YFP, et par Western Blot avec des anticorps spécifiques des sous-unités du complexe hétérotrimérique. Les 25 mL de culture sont quant à eux maintenus à 1.106 cellules.ml-1 jusqu’à l’arrêt de la division cellulaire
provoquée par l’infection par le baculovirus. 1 million de cellules sont prélevés toutes les 12 h pour mesurer le signal de fluorescence de la YFP. Le milieu contenant le virus amplifié (V1) est collecté par centrifugation douce (100 rcf ; 3 min) environ 48 h après arrêt de la division cellulaire. Les cellules sont resuspendues délicatement dans du milieu frais et récoltées à l’obtention du plateau de YFP et de CFP. Cette dernière étape permet d’analyser la production de l’ARN-polymérase sur gel de polyacrylamide et de valider le baculovirus.
CHAPITRE2| 2.2EXPRESSION DE L’ARN-POLYMERASE EN CELLULES D’INSECTE
MATERIEL ET METHODES
2.2 EXPRESSION DE L’ARN-POLYMERASE EN CELLULES D’INSECTE
Les cellules d’insecte Trichopulsia ni (Hi5) sont utilisées pour l’expression à grande échelle. Le métabolisme d’expression plus efficace des Hi5 est privilégié pour l’expression à grande échelle.
Des cultures de 250 mL de cellules d’insecte Hi5 à 0,5.106 cellules.mL-1 cultivées en milieu Express Five
SFM complété en L-Glutamine (Gibco, Life Technologies) sont infectées avec 0,2% de virus. Les cellules sont maintenues à 1.106 cellules.mL-1 jusqu’à l’arrêt de la division cellulaire. Les valeurs de YFP et de
CFP sont mesurées au fluorimètre (Tecan Infinite M200 Pro) (λ excitation YFP = 488 nm et λ excitation CFP = 430 nm) toutes les 24h jusqu’à l’obtention d’un plateau. Elles sont respectivement les témoins quantitatifs de la prolifération du virus et de l’expression protéique. Au plateau de fluorescence, les cultures sont centrifugées (15 min ; 1000 g) et les culots stockés à -80°C. L’expression en cellules d’insecte nécessite une semaine avec des cellules Hi5 (ce temps peut être plus long avec d’autres types de cellules d’insecte). En effet, il est nécessaire, en amont de l’infection, de préparer suffisamment de cellules à la concentration adéquate. L’expression se déroule sur trois ou quatre jours selon les performances du baculovirus.