B C RISTALLOGENESE INITIALE AVEC ET SANS ARN

In vivo, l’ARN-polymérase et l’ARN sont étroitement liés dans le contexte de la RNP et présentent une très forte affinité l’un pour l’autre. Lors des essais de cristallogénèse, le traitement d’une protéine pour lui fournir un environnement qui la maintient dans une conformation la plus stable possible est essentiel. Cette stabilité fait partie des trois facteurs primordiaux avec la solubilité et l’homogénéité de l’échantillon, directement corrélés à la probabilité d’une macromolécule à s’agencer de façon régulière dans l’espace et ainsi, à former des cristaux. Dans le cas de l’ARN-polymérase, l’ARN est susceptible de jouer un rôle stabilisateur. Les conditions de stabilité en présence d’ARN ont été testées par une expérience de stabilité thermique (TSA, Thermal Shift Assay). Les résultats du test de stabilité ont permis de sélectionner l’ARN apportant le plus haut degré de stabilité à l’ARN-polymérase tronquée.

Le principe du TSA repose sur la détection de l’état de repliement d’une protéine par une sonde hydrophobe fluorescente (Ericsson et al., 2006). La sonde n’est pas fluorescente en solution aqueuse. Par contre, elle fluoresce lorsqu’elle se fixe aux séquences hydrophobes d’une protéine, quand elle est dépliée. Lors d’un test de TSA, la température augmente progressivement provoquant le dépliement de la protéine et donc l’exposition du cœur hydrophobe permettant la fixation de la sonde. La fixation provoque une augmentation de la fluorescence. Une courte transition entre l’état replié et l’état déplié est observée. La température de fusion, Tm (melting temperature) est définie comme le point à mi-parcours de cette température de transition. L’augmentation de la fluorescence lors de cette transition se matérialise par des courbes appelées courbes de dissociation.

L’expérience de TSA a été menée avec des ARN de différentes tailles incluant tout ou partie de l’extrémité 5’ conservée des ARNv (5’ ARN) (Figure 51). La construction PACter-PB1∆Cter ne possède pas la partie

N-terminale de PB2. En absence de cette région, aucune affinité pour l’extrémité 3’ n’a été détectée lors des mesures qui ont été réalisées (cf. § 5.3, p 118). C’est pour cette raison que l’extrémité 3’ n’a pas été retenue pour les essais de stabilisation et de cristallisation. Le choix concernant la taille des ARN s’est limité à des ARN de courtes longueurs, comprenant seulement l’extrémité 5’ conservée, pour favoriser une fixation complète du segment d’ARN et éviter que des parties d’ARN restent libres et flexibles.

Figure 51 : Séquences des molécules d’ARN utilisées lors du test de stabilité thermique. Les résidus appartenant à la région 5’

conservée U13 apparaissent en vert alors que les résidus appartenant à l’extrémité 3’ conservée U12 apparaissent en rouge.

Les mélanges protéine / ARN ont été effectués à 4 °C dans des plaques 96 puits. La sonde hydrophobe fluorescente a été ajoutée juste avant d’insérer la plaque dans le système RT-PCR permettant la montée en température et la détection de la fluorescence. Les mesures ont été réalisées sur un intervalle de température allant de 24 à 85 °C (Figure 52).

CHAPITRE4| 4.2ETUDES PAR LES RAYONS-X ETUDE STRUCTURALE

Figure 52 : L’extrémité 5’ conservée de l’ARNv stabilise PACter-PB1∆Cter. Les tests de stabilité thermique ont été réalisés avec des

ARN de différentes tailles incluant tout ou partie de l’extrémité 5’ conservée des ARNv. La courbe de stabilité thermique de la protéine PACter-PB1∆Cter seule sans ARN est représentée par la courbe verte. Le tampon mélangé à la sonde est utilisé comme condition contrôle (courbe parme).

Par comparaison avec le Tm (45°C) observé pour la protéine seule (Figure 52, courbe et flèche vertes)

l’expérience de TSA montre que les ARN 5’ ayant une taille comprise entre 11 et 16 nt stabilisent la construction PACter-PB1∆Cter de manière identique (Tm = 55°C, Figure 52, flèche grise). L’ARN 5’ de 10 nt

stabilise moins la construction que ces derniers (Tm = 50°C, Figure 52, courbe et flèche bleues). Ce résultat

n’est pas surprenant puisque des études ont montré que les 11 premiers nucléotides en 5’ étaient nécessaires pour que l’ARN soit fixé spécifiquement par l’ARN-polymérase (Lee et al., 2002). Il est donc possible que l’ARN 5’ de 10 nt présente un défaut de fixation à l’ARN-polymérase qui pourrait être à l’origine de la moins bonne stabilisation observée. Les résultats observés en termes de stabilité thermique en présence d’un ARN inférieur à 10 nt de long sont donc en accord avec les données d’affinités déjà établies. L’ajout de l’ARN 3’ de 16 nt en combinaison avec l’ARN 5’ de longueur équivalente n’a aucune influence sur la stabilité thermique de la construction. Aucun effet n’est davantage observé après l’ajout de l’ARN 3’ seul (non montré) ou d’un ARN quelconque poly-UC. L’ARN 5’ de 12 nt a été retenu pour les tests de cristallisation car il fait partie des ARN les plus courts ayant un effet stabilisant.

La valeur de 45 °C obtenue pour le Tm de PACter-PB1∆Cter seule est assez faible. Il est généralement admis que la probabilité de cristallisation est maximisée si la température d’incubation des essais de cristallisation est au moins 25 °C en-dessous de la valeur de Tm calculée (Dupeux et al., 2011). Le Tm de la protéine seule suggère donc de réaliser les essais de cristallisation à 4 °C.

CHAPITRE4| 4.2ETUDES PAR LES RAYONS-X ETUDE STRUCTURALE

Initialement, 1728 conditions de cristallisation avec et sans ARN ont été testées à 4°C et à 20°C grâce à un robot de cristallisation haut-débit disponible au sein du PSB de Grenoble (HTX, EMBL Grenoble). L’automate a réalisé des gouttes assises de 200 nL (100 nL d’échantillon + 100 nL de tampon de cristallisation) disposées dans des plaques 96 puits spécifiques. Dans la condition avec ARN, l’ARN 5’ (12 nt) est ajouté directement dans l’échantillon dans un ratio protéine:ARN 1:1,2 quelques heures avant la réalisation des gouttes. Ce criblage préliminaire a permis d’isoler plusieurs conditions de cristallisation ayant fourni des cristaux (Figure 53). Le criblage à 20°C a fourni moins de cristaux que celui à 4°C

témoignant d’une meilleure croissance cristalline à faible température. Les essais de cristallisation se sont donc poursuivis à 4°C. Les cristaux obtenus avec et sans ARN présentent des formes cristallines différentes. Les conditions sans ARN fournissent des cristaux isolés les uns des autres en forme de cylindres à facettes de différentes tailles (Figure 53.A). L’ajout d’ARN provoque une modification de la

croissance cristalline et de la forme du cristal. Les cristaux avec ARN apparaissent sous forme de cubes déformés et maclés (Figure 53.B).

Figure 53 : Cristaux de PACter-PB1∆Cter initiaux obtenus à 4 °C par criblage haut-débit grâce à un robot de cristallisation. A/

Cristaux de PACter-PB1∆Cter obtenus sans ARN. B/ Cristaux de PACter-PB1∆Cter obtenus en présence d’ARN.