E.2. Les complexes (composition)

Le génome d’Arabidopsis contient un gène TOR, deux gènes RAPTOR et deux gènes LST8. L’interaction physique entre TOR et RAPTOR (Mahfouz et al., 2006) ainsi qu’entre TOR et LST8 (Moreau et al., 2012) ont été vérifiés.

I.E.2.a. La protéine AtTOR

La protéine TOR chez Arabidopsis a été pour la première fois décrite par Menand et al. (2002). Dans cet article, les auteurs décrivent le gène TOR comme étant unique chez Arabidopsis et c’est donc sur l’étude de ce gène que va porter cette partie.

I.E.2.a.iProfil d’expression

Une fusion traductionnelle de la protéine TOR avec le rapporteur GUS a permis de montrer que la protéine chimérique AtTOR-GUS est retrouvée essentiellement dans les parties de la plante où les divisions sont actives. Il s’agit notamment de l’embryon, de l’albumen et des méristèmes. Ainsi, on retrouve cette expression au niveau des méristèmes

L A B C D E F G H A B C D E F G H

AtTOR _actin8

M

Figure 9 : Localisation de l’expression de TOR chez Arabidopsis thaliana : A-K : Expression de la fusion traductionnelle AtTOR-GUS sous le contrôle du promoteur TOR (Menand et al., 2002) dans les embryons à différents stades d’évolution (A-D), lors de l’émergence des racines latérales (E-G), dans les feuilles (H), les primordia foliaires (I), les boutons floraux (J) et des cals d’un mois (K) (échelle : 50µm (A-D), 20µm (E-H), 500µm (I-K), ed = albumen, eb = embryon, cpt = chalaze, pr = racine principale, sam = méristème apical caulinaire.

L : Niveau d’expression du gèneAtTORet du gène de contrôleactin8dans les pointes des feuilles (A), les graines immatures (B), les feuilles entières (C), les tiges (D), les racintes (E), les fleurs (F) et les cultures cellulaires (G), (contrôle négatif H) (Robaglia et al., 2004)

apicaux caulinaires et racinaires et, également, au niveau des émergences des racines latérales, dès les premières divisions périclines des cellules du péricycle (Menand et al., 2002). Cette protéine chimérique n’est pas retrouvée dans les tissus différenciés, ni dans les tissus conducteurs (figure 9A-K).

Il semble néanmoins que l’ARN messager de TOR soit exprimé dans tous les tissus à un niveau d’expression équivalent. En effet, une étude du niveau d’expression des transcrits de AtTOR dans les cultures cellulaires, les tiges, les racines, les feuilles (feuilles entières, ou pointe des feuilles), les fleurs ainsi que dans les graines immatures n’a pas permis de révéler de différence d’expression de ce gène (figure 9L) (Robaglia et al., 2004). Ces résultats sont confirmés par le profil d’expression du gène TOR fourni par Genevestigator qui le montre également comme présent tout au long du développement de la plante (figure 9M) (Moreau et al., 2010). Robaglia et al. (2004) expliquent cette différence comme pouvant être due à la présence d’un uORF (upstream Open Reading Frame) dans le 5’ UTR de l’ARN messager de TOR. Cet uORF, de séquence bien conservée chez les différents écotypes d’Arabidopsis, pourrait jouer un rôle de régulateur post-transcriptionnel dans l’expression du gène AtTOR.

I.E.2.a.iiInfluence du niveau d’expression de TOR

Afin de mieux comprendre le rôle de TOR chez Arabidopsis, des études ont été réalisées en utilisant différentes lignées totalement déficientes en protéines (lignées T-DNA) ou présentant une baisse ou une hausse de l’expression de ce gène.

(a) Inactivation complète de TOR

Les premiers travaux portant sur l’impact de l’inactivation de TOR ont utilisés des lignées d’insertion T-DNA avec un insert positionné en amont du domaine FRB et ont révélés que l’absence d’une protéine TOR fonctionnelle entraine un arrêt du développement embryonnaire au stade globulaire (Menand et al., 2002). De manière intéressante, Robaglia et al. (2004) pointent du doigt le fait que les embryons avortés contiennent des cellules en cours de division et suggèrent que l’on doive mettre en corrélation l’arrêt du développement embryonnaire au stade globulaire avec la transition qui s’opère dans ce même stade vers des divisions qui deviennent couplées à la croissance alors qu’elles ne l’étaient pas avant.

tor-1 tor-2

tor-3 tor-4 tor-5

tor-6

tor-7 tor-8 tor-9

tor-12

tor-13 tor-14

N HEAT FAT FRB PI3K FATC C

200 µm

Figure 10 : Effet de l’inactivation complète de TOR chezArabidopsis thaliana: A : Localisation des différentes insertions de T-DNA dans les mutants testés par Menand et al. (2002) (bleu) et Ren et al. (2011) (vert et rouge). Les mutants tor-1 à -12(bleu et vert) entrainent une létalité embryonnaire à l’état homozygote tandis que les

A

D

Les mutants tor-1 à -12(bleu et vert) entrainent une létalité embryonnaire à l’état homozygote tandis que les mutantstor-13ettor-14ne perturbent pas le développement des plantes.

B à D : Aspect des embryons sauvages (B) ettor-1/tor-1(C) à différents stades de développement. Les embryons TOR-1/TOR-1 et TOR-1/tor-1 permettent de produire d’obtenir des graines matures tandis que les embryons mutants tor-1/tor-1 bloquent prématurément le développement de la graine (D) (Menand et al., 2002)

AlcR

Ethanol

AlcR

prom35S AlcR Term

promAlcA FRB FRB

prom35S FRB FRB Term

Figure 11 : Constructions permettant l’inactivation de TOR : A : Construction insérée dans les TOR RNAi constitutif exprimant une structure tige-boucle utilisant le domaine FRB spécifique de TOR, conduits sous le contrôle du promoteur constitutifs viral p35S. B : Construction insérée dans les TOR RNAi inductifs exprimant le RNAi sous le contrôle du système inductible à l’éthanol AlcR-AlcA.

A

Plus récemment, une autre équipe a voulu vérifié ces résultats et a analysé 12 lignées d’insertion T-DNA dans la séquence génomique de TOR (Ren et al., 2011). Parmi ces 12 lignées, neuf confirment les résultats obtenus par Menand et al. (2002) et aboutissent à un arrêt du développement embryonnaire aux stades 16 à 32 cellules (figure 10). Toutefois, ils sont également parvenus à obtenir 3 lignées T-DNA dont l’insertion à l’état homozygote n’entraine aucun défaut sur le développement embryonnaire. Ces trois lignées présentent toutes un insert au niveau de la région FATC de la protéine, suggérant que cette région pourrait ne pas être nécessaire à tout ou partie des fonctions de TOR, tout du moins chez les plantes.

(b) Impact de la sous-expression de TOR

Etant donné l’insensibilité d’Arabidopsis à la rapamycine et la létalité embryonnaire entrainée par l’extinction totale de TOR, une approche d’extinction partielle et/ou conditionnelle a été mise au point au laboratoire ainsi que dans celui de Christophe Robaglia (LGBP, Marseille). Elle repose sur l’utilisation d’un ARN interférant (RNAi) dirigé contre le domaine FRB de TOR et placé sous le contrôle d’un promoteur constitutif viral ou d’un système inductible à l’éthanol (figure 11).

L’utilisation de telles lignées exprimant un ARN interférant dirigé contre TOR de manière constitutive et ectopique a permis de mettre en évidence que le niveau d’expression de TOR est bien corrélé avec la taille des plantes et la résistance au stress osmotique (Deprost et al., 2007). Ces mêmes lignées ont également permis de montrer que l’inactivation de TOR entraine une activation du processus d’autophagie, comme cela a déjà été décrit chez d’autres eucaryotes (Liu and Bassham, 2010).

L’étude des lignées TOR RNAi inductibles a permis de mettre en évidence que l’inactivation complète de TOR conduit à un phénotype sévère d’arrêt complet de croissance (des parties aériennes comme racinaires), accompagné d’un jaunissement des feuilles dû à la dégradation des chlorophylles et à une sénescence prématurée (figure 12). Cet effet visuel de l’inactivation de TOR s’accompagne de nombreuses modifications métaboliques telles que l’accumulation des grandes quantités de sucres solubles, d’acides aminés et d’amidon, ainsi que l’induction des gènes impliqués dans la sénescence foliaire et la remobilisation des