Turbidimétrie
La turbidimétrie est une mesure d’absorbance à 350 nm, classiquement réalisée avec un spectrophotomètre, qui permet de suivre l’évolution de la turbidité, c’est à dire le caractère trouble d’une solution. Parmi les phénomènes pouvant provoquer une augmentation de la turbidité, on retrouve la formation d’agrégats protéiques.
La turbidimétrie a l’avantage de pouvoir être facilement mise en place. D’une part car les spectrophotomètres sont des machines facilement accessibles, et d’autres part car elle demande très peu de préparation au niveau de l’échantillon (pas de marquage ou d’immobilisation). Etant donné que de nombreux spectrophotomètres peuvent être équipés d’un module Peltier, la turbidimétrie permet dans ce cas-là d’étudier l’effet de la température sur l’agrégation des protéines.
Cependant, cette technique possède de nombreuses limites. La première est que certains agrégats ne provoquent pas d’augmentation de la turbidité en solution : ils ne sont donc pas détectables. Aussi, la turbidimétrie est très coûteuse en protéine et nécessite des quantités semblables à celles utilisées en RMN, c’est à dire 500 μL concentrés à plusieurs dizaines de micromolaires. Enfin, même s’il existe plusieurs types de cuves, il est la plupart du temps impossible de faire de nombreuses mesures en parallèle car les portoirs se limitent en général à des faibles nombres de cuves (jusqu’à 6-8 cuves en simultané).
Dynamic Light Scattering (DLS)
La DLS est une technique basée sur la détection de la lumière diffusée par les particules en solution au cours du temps. Les particules en solution suivent un mouvement
62 Brownien, c’est à dire qu’elles se déplacent aléatoirement. Elles ont chacune une vitesse propre, qui dépend de leur taille : les petites molécules se déplacent plus rapidement que les grosses. La DLS mesure ces vitesses (coefficients de diffusion) et se base sur l’équation de Stoke-Einstein afin d’en déduire le rayon hydrodynamique des particules en solution :
D Coefficient de diffusion des particules kB Constante de Boltzmann [m²kg/Ks²]
T Température [K] η Viscosité [Pa.s] RH Rayon hydrodynamique [m]
Comme pour la turbidimétrie, elle permet de suivre l’agrégation des protéines, mais a l’avantage de donner la taille des particules analysées. La DLS permet aussi de connaître la contribution de chaque population de particules dans la diffusion totale de la solution, et d’obtenir un indicateur rendant compte de la polydispersité de l’échantillon. De plus, il est possible de réaliser les expériences à plusieurs températures, et la cuve d’analyse demande une quantité assez réduite d’échantillon (50 μL concentrés à plusieurs dizaines de micromolaires).
Les limites de la DLS se situent au niveau de la gamme des tailles des particules détectables. La technique permet de mesurer le rayon hydrodynamique de particules compris entre 0,3 nm et 10 μm. Au-delà et en dessous de ces valeurs, la DLS ne sera pas capable de déterminer la taille des particules en solution.
En résumé, toutes ces techniques sont complémentaires et apportent des avantages et informations différentes lors de leurs utilisations combinées :
63 ITC RMN Turbidimétrie DLS Coût en échantillon (μL) 200 500 100 50 Etude d’interactions (signal mesuré) Chaleur
d’interaction résonance des noyaux Changement de * *
Etude d’agrégation (signal mesuré) - - Turbidité Diffusion des particules
Table 2 : Comparaison de plusieurs méthodes biophysiques permettant d’étudier les interactions et l’agrégation des protéines. * : seulement si l’interaction inhibe ou active
l’agrégation.
Cependant, dans le cas d’une étude nécessitant à la fois des tests d’interactions et d’agrégation, aucune de ces techniques ne permet à elle seule d’obtenir des résultats complets. L’utilisation de plusieurs techniques devient alors obligatoire, mais demande beaucoup d’échantillon. Nous nous sommes donc penchés sur le développement d’une nouvelle méthode pouvant fournir des informations moléculaires concernant les interactions et l’agrégation des protéines, et demandant une faible quantité d’échantillon.
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nanoDSF Prometheus NT.Plex : un outil
pour étudier les interactions et l’agrégation
des protéines
Le nanoDSF Prometheus NT.Plex est un appareil développé par NanoTemper et commercialisé en 2016. A l’instar de la calorimétrie différentielle à balayage (Differential Scanning Calorimetry, DSC), le nanoDSF Prometheus NT.Plex a été conçu pour étudier la thermostabilité des protéines, bien que les deux méthodes se différencient sur quelques points. Le premier est la nature du signal enregistré : alors que la DSC mesure l’échange de chaleur produit lors de la dénaturation, la fluorimétrie différentielle à balayage (Differential Scanning Fluorimetry, DSF) consiste en la mesure de la fluorescence émise par les protéines. Le second point est le nombre d’échantillons en simultané : les appareils DSC ne peuvent réaliser des mesures que sur un seul échantillon à la fois, tandis que le nanoDSF Prometheus NT.Plex peut lire 24 échantillons en simultané. Aussi, les deux appareils proposent des vitesses de chauffage des échantillons différentes (jusqu’à 7°C/min pour la DSF contre 4°C/min pour la DSC). Enfin, le nanoDSF Prometheus NT.Plex demande 10 µL d’échantillon, tandis que les appareils DSC en nécessitent 200 µL à concentration égale.
Pour ces raisons, le nanoDSF Prometheus NT.Plex apparaît comme une solution économique et efficace pour l’étude des interactions protéiques, grâce au signal d'émission de fluorescence des tryptophanes. A l'instar de la DSC, le nanoDSF Prometheus NT.Plex permet de mettre en évidence les interactions en observant l'influence du ligand sur la dénaturation de la protéine. Cet appareil permet de réaliser de larges gammes de concentrations de ligand au cours d'une seule expérience (jusqu'à 24 points), là où la DSC nécessite 24 expériences indépendantes. De plus, il présente l’avantage d’enregistrer aussi le signal de turbidité des échantillons au cours du chauffage, ce qui permet de suivre leur agrégation.
Cependant, dans certains cas, le nanoDSF Prometheus NT.Plex n’est pas adapté pour détecter les interactions moléculaires. C’est le cas de l’interaction tau - zinc, puisque la protéine tau ne possède aucun tryptophane et qu’elle est thermostable. Bien que
65 l’interaction entre les deux molécules ne soit pas visible, l’agrégation de tau induite par le zinc est détectable grâce à la mesure de turbidité de l’appareil. Pour cette raison ainsi que pour son faible coût d’échantillon, nous avons développé son utilisation à travers l’étude d’un sujet historique du laboratoire : la polymérisation de tubuline in vitro.
Avant de parler de ces résultats, il est important de présenter le mode de fonctionnement du nanoDSF Prometheus NT.Plex, ainsi que ses différentes spécificités.