Dosage des TBARS:

Principe :

Le dosage des TBARS selon la méthode de Yagi [132] nécessite tout d’abord la précipitation différentielle des protéines et des lipoproteines présentes dans le plasma par l’acide sulfurique et l’acide phosphotungstique. Cette étape initiale permet d’éliminer les autres substances tels que les aldéhydes, les acides aminés et les bilirubines, qui, peuvent interférer avec ce type de dosage.

Les substances qui réagissent avec les molécules d’acide thiobarbiturique forment des pigments fluorescents roses, cette réaction doit avoir lieu en milieu acide (pH 2-3) et à température de 90 à 100° C pendant une heure.

Le pigment fluorescent formé est extrait par le butanol aprés une étape de refroidissement brusque afin d’arrêter la réaction. L’intensité de la fluorescence obtenue est mesurée par un fluorimètre (λ d’excitation : 515 nm, λ d’émission : 553 nm)

Le taux des TBARS est exprimé en µmol/l de plasma et en référence à un standard (le 1,1,3,3- tétraethoxypropane) qui a été soumis aux mêmes conditions d’incubation que celle du dosage.

6. Détermination de la concentration de l’hémoglobine (Hb)

Ce dosage est effectué au laboratoire d’hématologie de CHU Farhat hached Sousse selon la technique de Drabkin (BIOLABO SA, Maizy France). Les ions Fe2+ de l’Hb seront oxydés en Fe3+ par le ferricyanure de Potassium pour donner la méthémoglobine, cette dernière réagit avec le cyanure de potassium (KCN) pour former la cyanméthémoglobine, un composé très stable, mesuré à 546 nm.

III. Etude statistique :

Les résultats obtenus ont été traités statistiquement à l’aide d’un logiciel SPSS (Statistical package for the social sciences) version 18.0Ce logiciel nous a permis de calculer les moyennes, les écarts types (±), les taux du significativité pour les différences des moyennes et les corrélations (P).

PARTIE 2 : ETUDE DE LA SUROXYDATION DES PEROXYREDOXINES :

1 –

Les cellules utilisées sont issues d’une lignée des fibroblastes embryonnaires les PMefs. Les PMEF (Primary mouse embryonic fibroblast) sont des cellules embryonnaires fibroblastiques de souris (prélevées sur embryons au stade E11). Le laboratoire dispose deux types de PMefs : les Mefs Srx +/+ et Mefs Srx -/-. Les PMefs sont cultivées dans un incubateur à 37°C, sous atmosphère à 5% de CO2, dans des boîtes de Pétri contenant 10 mL de milieu de culture : Dubecco’s Modified Eagle Medium, 10% de SVF (Serum de Veau Foetal) et 2,5 % de PS (Penicilline-Streptomycine).

Afin d’assurer le renouvellement des nutriments apportés aux cellules, on effectue un passage de celles-ci quand elles deviennent confluentes. On les décolle du fond des boites de Pétri avec 1,5 mL de trypsine à 25%, on laisse incuber 5 min à 37°c. Après les avoir détachées et centrifugées, on suspend les cellules dans 1 mL de milieu de culture, avant de les compter par cellule de Malassez. On dépose ensuite deux volumes de cellules (250µL et 100µL) dans deux nouvelles boîtes de Pétri contenant 10 mL de milieu chacune.

La synchronisation cellulaire :

A- Par choc sérique : Le protocole expérimental consiste à mettre en culture les Mefs en milieu DMEM sans SVF, 24 heures avant l’application du choc sérique. Le choc sérique consiste à ajouter le sérum de cheval (50%) durant 2h. Les cellules sont ensuite remises en milieu DMEM avec SVF et prélevées toutes les 4 h pendant 72 h.

B- Par choc thermique : Le protocole expérimental consiste à appliquer des cycles de température comme suivant : 12 heures à 32°c, 12 heures à 37°c et 12 heures à 32°c. Les cellules sont mises en culture en milieu de culture DMEM avec 10% de SVF (Serum de Veau Foetal) et 2,5 % de PS (Penicilline-Streptomycine).

2 – Immunoblot :

Matériel :

Lyse des cellules : Les cellules sont lavées avec du PBS (phosphate buffer saline), puis lysées, en utilisant le tampon RIPA (120 mMNaCl, 1% NP40, 0,5% SDS, 50mM tris pH8 , 1 mM

PMSF, 50 mM NEM, 0,2 mM EGTA, 0,2% DOC) avec un inhibiteur de protéases (complete EDTA-free). Après 10min à 4°C, les cellules sont récupérées et centrifugées à 13200rpm pendant 20 minutes. Après centrifugation, le surnageant est utilisé pour le dosage protéique. Dosage des protéines : La méthode de BRADFORD est utilisée pour doser la quantité de protéines présente dans le lysat cellulaire. On dilue 2μL d’échantillon dans 798 μL d’eau, puis on ajoute 200μL de réactif de BRADFORD. Les échantillons sont mis à 37°C pendant 10 min, avant la lecture spectrophotométrique . La gamme étalon est réalisée à partir d’une solution de BSA à 0,5mg/mL.

Préparation des échantillons : Le lysat est repris dans le tampon de charge Leammli 5x (125mM tris HCl ph 6,8 ; 2% SDS p/v ; 10% glycérol v/v ; 0,2 mg/ml de bleu de bromophénol ; 2,5% de β-mercaptoéthanol v/v selon la nature de test), chauffé 5min à 95°C, puis déposé sur un gel SDS PAGE.

Western blot : 20µg de chaque échantillon est déposé sur un gel d’acrylamide (8% ou 12% ou 15% selon le poids moléculaire de la protéine d’intérêt). La migration se fait dans un tampon de migration (running buffer :TrisHCl 3g/L, Glycine 14,4g/L ; SDS 1g/L) à 90V pendant 30min puis à 120V pendant 1h. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose en transfert semi-sec à 20V pendant 1h30, dans un tampon de transfert (TrisHCl 3g/L ; Glycine 14,4g/L ; SDS 0,4g/L ; 10% Isopropanol). Une fois le transfert terminé, la membrane est incubée dans une solution d’ODYSSEE pendant 30min. Ensuite, les protéines sont immunomarquées par les anticorps primaires spécifiques. La détection est effectuée après incubation avec un anticorps couplé à chromophore fluorescent par détection d’émission de fluorescence (appareil Licor Odyssey, Sciencetech).

3 – La PCR Quantitative : Principe :

La PCR quantitative en temps réel repose sur la possibilité de suivre au cours du temps (« en temps réel ») le processus de PCR à l’aide de la fluorescence. Les données de fluorescence sont collectées à chaque cycle de la PCR et représentent la quantité de produits amplifiés à cet instant. Une amplification PCR est composée d’une phase exponentielle, d’une phase linéaire

puis d’un plateau. La phase d’amplification exponentielle est celle pendant laquelle les réactifs ne sont pas limitants. Théoriquement, l’augmentation de la quantité de matrices à chaque cycle conduit à la formule mathématique suivante:

Qn = Qi (1 + ρ)n

où Qi est la quantité initiale de matrice, Qn est la quantité de matrice obtenue au cycle n et ρ le rendement de la réaction PCR (ou efficacité). Dès la phase linéaire, le rendement d’amplification diminue fortement et devient variable d’un échantillon à un autre. A l’étape de renaturation il se produit une compétition entre la renaturation des amplicons et l’hybridation des amorces. Pendant la phase de plateau, les réactifs deviennent limitants, le taux d’amplification décroît et ainsi très peu de nouveaux amplicons sont générés.

Plus l’échantillon est concentré en molécules cibles à l’origine, moins il faudra de cycles pour atteindre un point pour lequel le signal fluorescent est significativement supérieur au bruit de fond. Ce point est défini comme le Ct et apparaît en début de phase exponentielle. Le Ct

représente le nombre de cycles n nécessaires pour atteindre une quantité de matrice (Qt) définie arbitrairement par le logiciel. Moins il y a de matrices au départ, plus le Ct sera élevé

Pour détecter les amplicons générés lors de la PCR quantitative, on utilise une «sonde» fluorescente dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction de PCR. Le SYBR Green est un agent intercalant fluorescent qui ne se lie qu'à l'ADN double brin et qui n’inhibe pas la réaction d’amplification. L’émission fluorescente du SYBR Green augmente lorsqu’il est intercalé à l’ADN double brin.

Lorsque la PCR est suivie en temps réel, l’augmentation du signal de fluorescence est observée en fin de chaque étape de polymérisation. Si on suit cette fluorescence au cours du temps d’une PCR en temps réel. L’augmentation de signal est lié au nombre de fragments PCR en 3 phases distinctes :

- Phase de bruit de fond : La quantité de fragment amplifié est insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond (et donc la fluorescence générée).

- Phase exponentielle : La quantité de fragment amplifié génère un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l’appareil, puis le nombre de produits amplifié double à chaque cycle. En coordonnées logarithmiques, cette phase est représentée par une droite.

- Phase de plateau (ou de saturation) : certains composants de la réaction (et en particulier le nombre de molécules de Taq disponibles) deviennent limitants. Le système ne permet plus une amplification exponentielle.

Matériel :

A. Extraction des ARN totaux :

Environ 20 mg de tissu animal est utilisée pour extraire les ARNs totaux suivant les recommandations du kit RNeasy Plant Mini Kit commercialisé par Qiagen. Le principe de ce Kit est basé sur la fixation sélective de l’ARN sur une résine (gel de silice) contenue dans une colonne centrifugeable. En résumé, 20 mg de tissu animal (bien broyé) sont lysés dans le tampon dénaturant à base d'isothiocyanate de guanidine (tampon RLT, utilisé à raison de 450µl par 100mg d'échantillon) additionné de β-Mercaptoethanol (1µl pour 100µl de tampon de lyse). L’ensemble est homogénéisé par pipetages successifs. Après une incubation de 3 min à 56°C, le mélange est déposé sur une première colonne et centrifugé pendant 2 min à la vitesse maximale. Un demi-volume d’éthanol est additionné à l’éluat. La suspension est déposée sur une deuxième colonne et centrifugée pendant 15s à 8000 xg. La colonne est lavée par 700µl de tampon RW1 en faisant une centrifugation à 8000 xg pendant 15s. Les ARN fixés à la colonne sont ensuite traités deux fois par un tampon de lavage RPE (500 µl) contenant de l'éthanol en faisant à chaque fois une centrifugation à 8000 xg (15s puis 2min). L'élution des ARN est réalisée en déposant sur la colonne 30 µl d’eau RNase-free (RNase-free water). L'éluat est récupéré en centrifugeant la colonne à 8000 xg pendant 1 min.

B. Dosage des ARN obtenus :

Le dosage des ARN est effectué par spectrophotométrie à 260 nm.

La qualité de l’ARN est contrôlée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1%

C. Traitement à la DNAse

Pour éliminer toute trace d’ADN génomique résiduel, un traitement à la DNAse est effectué. Les ARNs totaux extraits sont traités à la DNAse RNAse free à raison de 1U/μg d’ARNs en présence du tampon approprié. La réaction est ensuite incubée à 37°C pendant 1h. Pour inactiver la DNAse, 1µl de RQ1 DNase Stop Solution est ajouté à la réaction. La réaction est enfin incubée pendant 10 min à 65°C

D. Transcription inverse

La transcription inverse est réalisée à partir de 2 μg d’ARN traités à la DNase.

Deux séries de tubes PCR sont préparées : une série « RT+ » contenant 2 µg d’ARN dans 16 µl d’eau DEPC et une série des tubes « RT-« contenant 250 ng d’ARN dans 4 µl d’eau DEPC.

Des tubes Mix ont été préparés :

- Tube Mix oligo contenant : H2O, Tampon RT, Random primer, RNAsin 40 U/µl - Mix RT+ contenant : H2O, Tampon RT, DTT 0,1 M, dNTP 5mM, enzyme MMLV - Mix RT- : H2O, Tampon RT, DTT 0,1 M, dNTP 5 mM

Les solutions Mix oligo preparées précédemment sont ajoutées, aux tubes RT+ et RT-. L’ensemble a été mis en machine PCR et un programme RT est saisi :

- Incubation 3 minutes à 80°c

- Maintien à 30°c : ajouter des Mix RT+ et Mix RT- de la RNase H - 10 minutes à 37°c

- 1 heure à 42°c

- 10 minutes à 37°c pour ajouter la RNase H - 20 minutes à 37°c

- 10 minutes à 80°c pour inactivation de la RNase - incubé 3 min à 80°c

Conserver les ADNc à -20°c

E. Protocole de la PCR quantitative :

Sur les solutions ADNc diluées, des préparations Mix PCR Oligo ont été ajoutées, contenant : 2X SYBR Green PCR Mix, de Fluoresceine 1/1000, H2O et les oligos. Le mélange réactionnel se fait dans un volume final de 25 μl.

L’appareil utilisé est le Bio Rad IQ5 (Invitrogen Life Science Technologies).

Les cycles sont ceux d’une PCR classique, mais pour des durées beaucoup plus courtes. Le programme se compose comme suit :

Une première phase de dénaturation se déroule pendant: 5min à 95°C pour dénaturer l’ADN et activer l’enzyme

2. L’amplification se découpe en 45 cycles de trois phases chacun. · Une phase de dénaturation à 95 °C qui dure10s

· Une phase d’hybridation des amorces réalisée à 64 °C et qui dure10s · Une phase d’élongation à 72 °C d’une durée de10s

3. Mesure de la spécificité de l’amplification « melting curve »

4. Dosage des ROS par FACS :