CHAPITRE II :MATERIEL ET METHODES
III- Méthodes analytiques
III.1- Dosage du chlore
III.1.2- Dosage par la méthode spectrophotométrique à la DPD ... 61 III.2- Dosage du brome ... 61
III.3- Dosage des solutions d’haloamines ... 62
III.3- Dosage de BP3, MP et des compétiteurs. ... 62 III.4- Identification des sous-produits d’oxydation ... 63
IV- Etude et suivi de la toxicité ... 66 V- Modélisation de la dégradation de BP3 et MP ... 66
I-
Réactifs et solutions
L’eau utilisée pour la préparation des solutions a été purifiée par un système MilliQ de Millipore avec une résistivité de 18 MΩ.cm et une teneur en carbone organique dissous inférieure à 0,1 mg.L-1. Tous les composés chimiques employés, de plus haute pureté
commerciale, ont été utilisés directement sans purification préalable.
I.1- Solutions de 3-benzophénone et de methylparabène
Dans ce travail, deux molécules souvent présentes dans les produits de soins corporels ont été considérées : la 3-benzophénone (BP3) et le methylparabène (MP). Il s’agit du filtre UV et du conservateur les plus utilisés sur le marché dans les formulations des produits de soins.
Le tableau II.1 représente les structures chimiques ainsi que les caractéristiques physico-chimiques des molécules choisies.
Tableau II.1:Caractéristiques physico-chimiques de BP3 et de MP (Mercks, Jewell et al., 2007)
Nom INCI 3-Benzophénone (BP3) Methylparabène (MP)
Nom commercial Eusolex 4360 E218
Formule moléculaire C14H12O3 C8H8O3
Formule développée
Masse Molaire (g/mol) 228,25 152,15
Numéro CAS 131-57-7 99-76-3
Solubilité dans l’eau 3,7 mg/L (à 20°C) 20 g/L (à 20°C)
Log KOW 3,52 1,66(c)
λmax (nm) 290 254
pKa 9,6(a) 8,4(b)
Température d’ébullition 150-160 °C 298,6 °C
Température de fusion 66°C 125-128°C
La 3-benzophénone et le methylparabène ont été fournis par Alfa Aesar GmbH ₰ Co.KG et Sigma Aldrich respectivement avec une pureté supérieure à 98 %.
La 3-benzophénone (BP3) étant très peu soluble dans l’eau, une solution mère (3 mM) a été préparée dans du méthanol. Les solutions filles, ainsi que la gamme d’étalonnage située entre 0,05 μM et 1,5 μM, ont ensuite été préparées par dilution dans de l’eau MilliQ.
Pour les études d’oxydation, des solutions mères dans l’eau ont été utilisées. Pour cela, les solutions de BP3 ont été préparées après mise en contact pendant 24 heures sous agitation de 15 à 25 mg de BP3 par litre d’eau MilliQ puis filtration de la solution sur membrane de 0,45 μm pour éliminer la partie non solubilisée du composé. A partir de gammes étalons préparées par dilution dans l’eau MilliQ de solutions mères préparées dans le méthanol, les concentrations effectives en composés ont alors été déterminées par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP). Dans ces conditions la concentration moyenne obtenue pour BP3 a été de 35 μM.
Le méthylparabène (MP) présente une solubilité dans l’eau de 2 g/100mL à 25°C (Jewell et al., 2007). Les solutions mères de MP ainsi que les gammes étalons entre 0,05 μM et 1,5 μM ont été alors préparées directement dans de l’eau MilliQ.
I.2- Solutions des compétiteurs : phénol et
17α-ethinylestradiol
(EE2)
Les compétiteurs choisis pour les expériences de cinétique de bromation sont le phénol et la 17α-ethinylestradiol (EE2). Le phénol a été fourni par ProLabo et le 17α-ethinylestradiol par Sigma Aldrich avec une pureté supérieure à 98 %.
Pour toutes les expériences de bromation, les solutions mères (3 mM) des compétiteurs ont été préparées dans l’eau MilliQ pour le phénol et dans le méthanol pour 17α- ethinylestradiol. Les solutions filles, ainsi que les gammes étalons ont été préparées dans de l’eau MilliQ et à des concentrations entre 0,05 μM et 1,5 μM.
I.3- Solution de chlore
Les solutions de chlore utilisées au cours de toutes les expériences de cinétique, identification des sous-produits et suivi de toxicité ont été préparées quotidiennement par
dilution dans l’eau à partir d’une solution commerciale d’hypochlorite de sodium 13 % (2 M) contenant des quantités équimolaire de chlore libre et d’ions chlorure.
I.4- Solution de brome
La solution de brome a été préparée par ajout d’un volume donné d’une solution de KBr (0,1 M) à une solution d’eau ozonée tel que [Br-]/[O
3]= 0,9 (T = 5°C ; ajusté à pH= 4 par
ajout d’acide phosphorique). Le rapport [Br-]/[O
3]= 0,9 a été choisi de façon à ce que tout
l’ozone dissous réagisse avec Br- en excès, et ainsi éviter la formation de bromates
susceptibles d’être obtenus par action de l’ozone sur le brome formé.
A partir des solutions d’ozone dissous préparées par barbotage d’ozone gaz, les concentrations de brome obtenues ont été comprises entre 0,2 mM et 0,5 mM. La solution de brome est ensuite conservée pendant un mois à pH 11 (ajusté par ajout de NaOH) au frais et à l’abri de la lumière.
I.5- Solution de monochloramine
La solution de monochloramine a été préparée en ajoutant lentement une solution concentrée de chlore dans une solution de chlorure d’ammonium tamponné à pH 8,5 par des sels de phosphate. Le rapport molaire N/Cl ([azote ammoniacal]T/[HOCl]T) choisi est égal à 2.
Dans cette gamme de pH et de rapport N/Cl, on ne forme que de la monochloramine NH2Cl.
Au cours des expériences de monochloramination de BP3 et de MP, la concentration initiale de la solution de NH2Cl préparée était de 2 (± 0,2) mM.
I.6- Solution de monobromamine
La solution de monobromamine a été préparée en ajoutant lentement une solution concentrée de chlorure d’ammonium dans une solution de brome à pH 8,5 (ajusté par ajout de NaOH). Le rapport molaire N/Br ([azote ammoniacal]T/[HOBr]T) choisi est égal à 102 afin de
se trouver dans les conditions de gamme de pH et de rapport N/Br, favorisant la formation exclusive de la monobromamine NH2Br dans le milieu (Johnson et Overby, 1971). Les
I.7-
Solutions de NaDCC et de ATCC
Les cristaux de sel de sodium de l’acide dichloroisocyanurate (NaDCC) et de l’acide trichloroisocyanurique (ATCC) ont été fournis par Sigma Aldrich avec une pureté supérieure à 95%.
Les solutions de chloroisocyanurates ont été préparées en dissolvant ≈ 40 mg de NaDCC ou ≈ 35 mg ATCC dans 250 mL d’eau MilliQ.
Il faut noter que le NaDCC se dissout immédiatement dans l’eau, cependant l’ATCC nécessitait un temps d’agitation de 12 h avant d’avoir une dissolution totale.
II- Protocoles expérimentaux
II.1- Etude cinétique
Les expériences d’oxydation (chloration, bromation et haloamination) ont généralement été effectuées à partir de solutions préparées dans de l’eau MilliQ tamponnées au pH souhaité par des sels de phosphate (force ionique μ = 2.10-3 M) (à l’exception de
l’expérience de monobromamination). Le pH a été ajusté pour certaines expériences par ajout de NaOH et H2SO4 si nécessaire.
Les études cinétiques ont été réalisées selon la méthode de cinétique par dégénérescence d’ordre ou la méthode de cinétique compétitive. Le choix de la méthode se fait en fonction de la vitesse de réaction entre l’oxydant et la molécule considérée.
II.1.1- Etude cinétique par dégénérescence d’ordre
La méthode d’étude cinétique par dégénérescence d’ordre consiste à faire réagir une molécule M, dont on cherche la constante cinétique de réaction, en présence de l’oxydant présent en excès, de façon à considérer que la variation de la concentration en oxydant est négligeable par rapport à la concentration de la molécule considérée (M) pendant toute la durée de l’expérience.
Dans ces conditions, pour le chlore, la réaction peut s’écrire sous la forme suivante :
M + HOCl
𝐾𝐻𝑂𝐶𝑙/𝑀
En supposant que la vitesse de décomposition du composé réponde à une loi cinétique d’ordre 2, la relation suivante peut alors être considérée :
v=-d[M]T
dt = kHOCl/M[M]T[HOCl]T (II.2)
qui devient :
v=-d[M]T
dt =kobs[M]T (II.3)
lorsque [HOCl]T = [HOCl]T,0, avec kobs = kHOCl/M[HOCl]T (II.4)
Soit encore, ln [M]T,t= -kobst + ln [M]T,0 (II.5)
avec :
kHOCl/M : constante cinétique apparente de chloration de second ordre (déterminée pour
un pH donné)
kobs : constante cinétique de pseudo-premier ordre
La méthode d’étude cinétique par dégénérescence d’ordre est employée pour la détermination de constantes de vitesses inférieures ou égales à 103 M-1.s-1. Cette méthode
n’est cependant pas envisageable pour la détermination de constantes cinétiques élevées (>103
M-1.s-1). Dans ces conditions, il est nécessaire d’utiliser la méthode d’étude par cinétique
compétitive.
II.1.2- Méthode par cinétique compétitive
La méthode par cinétique compétitive consiste à faire réagir un composé M, dont on cherche la constante cinétique de réaction vis-à-vis d’un oxydant (le brome dans cette étude), en présence d’un compétiteur C, composé dont on connaît parfaitement la constante cinétique de réaction vis-à-vis de cet oxydant.
Dans ces conditions, les réactions globales observées sont :
M + HOBr𝑘→ 𝐻𝑂𝐵𝑟/𝑀sous-produits de M (II.6)
C + HOBr𝑘→ 𝐻𝑂𝐵𝑟/𝐶sous-produits de C (II.7)
En supposant que les vitesses de décomposition de M et C répondent à une loi cinétique d’ordre 2, les relations suivantes peuvent alors être écrites :
v=-d[M]T
dt =kHOBr/M[M]T[HOBr]T (II.8)
v=-d[C]T
dt =kHOBr/C[C]T[HOBr]T (II.9)
Soit, comme M, C et HOBr sont présents simultanément dans la solution :
d[C]T [C]T = kHOBr/C kHOBr/M d[M]T [M]T (II.10) ou encore, ln[C]T,t [C]T,0= kHOBr/C kHOBr/M ln [M]T,t [M]T,0 (II.11)
avec kHOBr/M et kHOBr/C les constantes cinétiques apparentes de second ordre du composé M et du compétiteur C.
Le rapport kkHOBr/M
HOBr/C peut être obtenu graphiquement à partir de la pente de la droite ln[C]T,t
[C]T,0=f( ln [M]T,t
[M]T,0) après détermination expérimentale de [M]T,0, [C]T,0, [M]T,t et [C]T,t. A
partir de la constante cinétique kHOBr/C, la constante cinétique kHOBr/M peut alors être calculée.
La méthode de cinétique compétitive est communément employée pour la détermination de constantes cinétiques élevées, supérieures à 103 M-1.s-1. Elle est applicable
uniquement lorsque l’oxydant est la seule entité qui réagit sur M et C. Le compétiteur C choisi doit répondre à 3 critères :
-sa constante cinétique de réaction avec l’oxydant doit être proche de celle de la molécule M étudiée,
-il ne doit pas être un sous-produit de réaction de M,
-il ne doit pas redonner M en se décomposant ou former un sous-produit sortant au même temps de rétention que le composé M.
II.2-
Etude de l’influence de la concentration en ions bromure et en
azote ammoniacal au cours de la chloration
Des expériences ont été réalisées pour étudier l’influence des ions bromure et de l’azote ammoniacal de la matrice inorganique de l’eau au cours de la chloration de MP et BP3 (en présence du chlore libre ou de chloroisocyanurates).
Les expériences de chloration ont été effectuées pour chaque molécule à pH 7 et pH 8,5 dans des réacteurs fermés à l’abri de la lumière et à température ambiante (20 ± 2°C). Dans le cas de la 3-benzophénone, les conditions choisies ont été de 1,5(± 0,2) μM BP3, 5 (± 0,5) μM chlore, et des concentrations d’ions bromure et d’azote ammoniacal entre 0 et 5 μM. Quant au methylparabène les concentrations initiales choisies étaient de 1,8 (± 0,2) μM BP3, 10 (± 0,5) μM chlore, et des concentrations d’ions bromure et d’azote ammoniacal comprises entre 0 et 10 μM.
Le même protocole expérimental a été employé pour les deux molécules. A t= 0 min, le chlore (VChlore= 1,7 mL pour les expériences avec BP3, Vchlore=3,4 mL pour les expériences
avec le MP, de solution mère de chlore à 3 (±0,5) mM) est rajouté dans les réacteurs (Vréacteur
= 1 L) contenant des solutions tamponnées d’ions bromures et/ou d’azote ammoniacal de différentes concentrations, et des prélèvements (V = 1,5 mL) à différents intervalles de temps sont réalisés dans des vials contenant un excès de thiosulfate de sodium (V= 20 µL d’une solution de Na2S2O3 à 100 g/L). Ainsi, les concentrations résiduelles en BP3 et MP à
différentes intervalles de temps ont alors été déterminées par analyse CLHP-UV.
Concernant les expériences en présence des chloroisocyanurates, le même protocole a été employé à pH 8,5 (pour les expériences avec BP3 VNaDCC= 2,5 mL, VATCC = 1,25 mL,
[BP3]T,0 = 1 μM; pour les expériences avec MP VNaDCC= 5 mL, VATCC = 2,5 mL, [MP]T,0 = 1-
2 μM; solutions mères de ATCC à 0,6 (±0,05) mM et NaDCC à 0,4 (±0,05) mM ; Vréacteur =
0,5 L).
II.3- Identification des sous-produits et suivi de la toxicité au cours
de l’oxydation
L’identification des produits de transformation a été réalisée après mise en contact de solutions de BP3 et MP en présence de doses croissantes d’oxydants (i.e. chlore ou brome) à pH 7. Des concentrations initiales de BP3 et MP ont été choisies telles que [BP3]T,0 = 30 µM
et [MP] T,0= 50 µM. Les doses d’oxydants choisies ont été comprises entre 0 ≤
[HOX]T,0/[M]T,0 ≤ 3,5 et les analyses ont été realisées après un temps de contact de 24 h sur
un système CLHP/UV/SM.
De la même manière, les échantillons utilisés pour le suivi de la toxicité au cours de l’oxydation de BP3 et MP ont été préparés pour des doses d’oxydants comprises entre 0 ≤ [HOX]T,0/[M]T,0 ≤ 3,5 à pH 7 (tamponnées par ajout de sels de phosphate). Les concentrations
initiales en molécules M ont cependant été choisies proches de la valeur de 1,5 à 2 x EC 50 de M, et les expériences de suivi de la toxicité ont été realisées après un temps de contact de 24 h de manière à s’assurer de l’absence de concentration résiduaire en oxydant dans le milieu.
III- Méthodes analytiques
III.1- Dosage du chlore
Le dosage du chlore libre a été réalisé selon deux méthodes en fonction des concentrations en chlore. Pour les solutions les plus concentrées comme la solution commerciale d’hypochlorite de sodium et la solution mère de chlore, un dosage par iodométrie a été employé. Cependant, pour les solutions plus diluées de chlore un dosage en utilisant la méthode spectrophotométrie à la DPD a été choisi.