Au cours de cette étude nous avons décidé de nous intéresser à l’évolution du virus de la PPA à travers le monde, sans nous restreindre à l’échelle régionale. Pour ce faire, nous avons utilisé le panel le plus exhaustif d’isolats viraux. Ces isolats ont plusieurs provenances. Les sources les plus abondantes de données de séquences sont les banques publiques de données. Ainsi, la majorité des souches de virus que nous avons utilisées provient de la banque de données GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) et de la banque de données disponible sur le site internet du CISA-INIA (http://webainia.inia.es/cisa/asfv/index.asp).
1-2- Les isolats malgaches
Madagascar a été atteint par le virus de la PPA à la fin des années 1990, aussi, peu de données de séquences sont actuellement disponibles à partir des banques publiques. Au cours de cette étude nous avons isolé 21 souches virales malgaches à partir de rates de porcs domestiques prélevées lors d’évènements épidémiques ayant eu cours dans l’île entre 1998 et 2008. Vingt-et-un échantillons ont été sélectionnés selon leur date et lieu de prélèvement de façon à couvrir l’espace-temps. Après isolement viral sur macrophages alvéolaires de porc, nous avons séquencé des gènes ou fragments de gènes et généré ainsi 39 séquences inédites de virus PPA malgaches : 12 séquences du gène B646L, 10 séquences du gène E183L et 17 séquences du gène CP204L.
Pour d’avantage de détails sur les isolats que nous avons utilisés au cours de cette étude, se reporter à l’annexe 1.
1-2-1- Préparation des macrophages alvéolaires
Les macrophages alvéolaires sont extraits à partir de poumons de porc par lavages au PBS 1X. Les alvéoles pulmonaires n’étant pas un milieu stérile, le PBS 1X est supplémenté de pénicilline (20 U/ml), de streptomycine (20 µg/ml) et d’Amphotericin B (0,5 µg/ml) (Gibco) afin de limiter le développement tant des bactéries que des champignons. Après culottage des cellules, les macrophages sont remis en suspension dans du milieu de culture puis les
cellules vivantes sont énumérées dans une cellule de Malassez avec le colorant vital d’exclusion bleu trypan. Les cellules sont ensuite mises en culture à la concentration de 4,5 x
105 cellules par cm², soit 8,5 x 105 cellules par puits en plaque 24 puits (Falcon). Les
macrophages sont cultivés à +37°C en présence de 5% de CO2, dans du milieu MEM
contenant des sels de Earle et de l’HEPES (Eurobio) supplémenté de sérum de fétus de bovin (SFB) ainsi que de pénicilline (20 U/ml) de streptomycine (20 µg/ml) et d’Amphotericin B (0,5 µg/ml) (Gibco).
1-2-2- Isolement viral
Après une nuit d’incubation, le milieu de culture est retiré et les cellules sont lavées dans du PBS 1X. L’isolement viral est effectué au moyen d’homogénats de rates clarifiés dans du milieu MEM. Les macrophages alvéolaires de porc sont inoculés avec 200 µl de surnageant d’homogénat clarifiés puis mis en incubation à 37°C sous atmosphère de 5% de
CO2 pendant une heure, avec agitation de la plaque toutes les 15 minutes. L’inoculum est
alors retiré et remplacé par du milieu de culture MEM plus sels de Earle et HEPES frais contenant 5% de SFB et supplémenté de pénicilline (20 U/ml), de streptomycine (20 µg/ml) et d’Amphotericin B (0,5 µg/ml) (Gibco). Après 5 jours d’incubation, les cultures virales sont congelées et décongelées deux fois à -80°C. Le milieu de culture est ensuite transféré, clarifié à 3000 g pendant 10 minutes. Le surnageant de culture est alors conservé à -80°C jusqu’à utilisation.
1-2-3- Purification de l’ADN viral
L’ADN du virus PPA a été purifié à partir de 200 µl de surnageant clarifié de culture au moyen du Kit GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham Biosciences) et selon le protocole prévu par le fabriquant pour l’extraction de l’ADN à partir de sang total. L’ADN purifié a été élué des colonnes de purification dans 100 µl d’eau ultra pure stérile.
1-2-4- Amplification des gènes viraux
La réaction de polymérisation en chaine a été effectuée avec la polymérase FailSafe (Tebu Epicentre). Cette polymérase a la caractéristique d’être très fidèle au brin matrice
avec un taux d’erreur d’incorporation des nucléotides lors de la réplication de 3,3 x 10-5. Les
gènes cibles ont été amplifiés grâce aux amorces spécifiques suivantes : VP72-d (5’-GGCACAAGTTCGGACATGT-3’) et VP72-U (5’-GTACTGTAACGAAGCAGCACAG-3’) pour le gène
B646L, E183Lfor_p54 GGTTGGTTTTCAAATGTTGGCGAAGGTA-3’) et E183Lrev_p54 CCATAAATTCTGTAATTTCATTGCGCCACAAC-3’) pour le gène E183L, et p30/32-P1 (5’-TGCCAAGCATACATAAGTTG-3’) et p30/32-P2 (5’-ATTTTGCTGTTTATGAATCC-3’) pour le gène CP204L. Le milieu réactionnel contenait 100 ng d’ADN total extrait, 0,5 µM de chaque amorce et 2,5 U de polymérase, complété à 25 µL avec de l’eau ultra pure stérile. Le mélange réactionnel a ensuite été additionné de 25 µL de tampon PCR FailSafe C 2X.
Les réactions de polymérisation ont été réalisées comme suit : un cycle de dénaturation de 95°C pendant 5 minutes suivi de 30 cycles comprenant une dénaturation de 30 secondes à 95°C suivie d’une hybridation de 30 secondes à 50°C pour les gènes B646L et CP204L et 55°C pour le gène E183L et enfin, une élongation à 72°C de 30 secondes pour le gène B646L, de 45 secondes pour le gène E183L et de 50 secondes pour le gène CP204L. A la fin des 30 cycles, une élongation finale de 3 minutes à 72°C a alors été réalisée pour terminer la réaction.
La taille des produits d’amplification a été révélée par illumination aux rayons UV après une électrophorèse dans un gel d’agarose à 0,8% en tampon Tris Acétate EDTA (TAE) 1X contenant du bromure d’éthidium (BET), contre un marqueur de poids moléculaire de 100 pb (Biolabs). Les bandes correspondant aux tailles attendues ont ensuite été découpées dans le gel d’agarose puis purifiées aux moyens du kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience) selon le protocole du fournisseur. Les amplicons ont été élués de la colonne de purification dans 25 µl d’eau ultra pure stérile et ont été directement utilisés pour le clonage. Il est à noté que l’illumination de l’ADN sous rayonnement UV a été la plus brève possible afin de limiter la formation de dimères de bases pyrimidines.
1-2-5- Clonage T-A des amplicons PCR
Les extrémités des produits PCR générés par la polymérase du kit PCR FailSafe sont de deux types : l’activité endonucléasique de l’enzyme génère des extrémités franches d’ADN, tandis que son activité 3’ exonucléasique accroche en fin d’élongation une adénine non comprise dans la matrice à l’extrémité 3’ de l’amplicon. Cette adénine supplémentaire permet de liguer de façon cohésive l’amplicon dans le plasmide pCR2®.1-topo (Invitrogen), plasmide ouvert dont les extrémités 3’ terminales sont pourvues d’une thymine non appariée. Outre la thymine cohésive à son extrémité 3’, ce plasmide dispose d’une topoisomérase fixée à chaque extrémité qui permettra la ligation de l’amplicon. La ligation a ainsi été réalisée dans un mélange réactionnel contenant 50 ng de plasmide, l’insert (1:3), 1 µl de tampon 6X du kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen), complété à 6 µl avec de l’eau ultra pure stérile et incubé pendant 5 minutes à température ambiante. La réaction enzymatique a ensuite été stoppée en plaçant le mélange dans de la glace.
1-2-6- Transformation des bactéries
Suivant la réaction de ligation, des bactéries Escherichia Coli Top10 (Invitrogen) chimio-compétentes ont été transformées par choc thermique avec 2 µl de la réaction de ligation. Les bactéries mélangées à l’ADN ont d’abord été incubées dans de la glace pendant 30 minutes. Elles ont alors reçu un choc thermique à 42°C pendant 30 secondes puis ont été replacées dans de la glace pendant 2 minutes. Le mélange a alors été complété avec 250 µl de milieu SOC à température ambiante et placé en incubation à +37°C pendant une heure sous agitation (220 t/m). Les bactéries transformées ont alors été ensemencées sur un milieu gélosé Lysogeny Broth (LB) contenant 30 µM d’ampicilline, 0,2 mM de X-Gal ainsi que 0,5 µM d’IPTG. Les boites de Pétri ainsi ensemencées ont alors été incubées pendant une nuit à +37°C.
1-2-7- Sélection des clones bactériens transformés
Le site d’insertion du plasmide pCR2®.1-topo se situe au milieu du gène Lac-Z codant pour la béta-galactosidase, une enzyme capable de métaboliser le X-Gal. Le produit de métabolisation du X-Gal, couplé à l’IPTG présent dans le milieu de culture entraine la formation d’une coloration bleue des bactéries. Ainsi, si le plasmide s’est refermé en intégrant l’insert, le gène, interrompu, ne pourra coder pour une enzyme fonctionnelle et les colonies bactériennes resteront blanches. En revanche, si le plasmide s’est refermé sur lui-même au cours de la ligation, le gène sera fonctionnel et les colonies bactériennes seront bleues. La première sélection des clones bactériens se fait donc en fonction de la coloration blanc/bleu des colonies. La seconde étape de sélection est faite d’un point de vue moléculaire. En effet, il convient de s’assurer que l’insert intégré dans le plasmide corresponde à l’amplicon PCR produit. Pour le vérifier, des colonies blanches ont été sélectionnées pour effectuer une réaction d’amplification génique de leur insert au moyen des amorces spécifiques décrites en 1-2-4-. Chaque colonie individuelle a été plongée directement dans un milieu réactionnel contenant 2,5 U de polymérase (QIAGEN), 1 µM de chaque amorce, 200 µM de chaque dNTP, 2,5 µl de tampon 10X et de l’eau ultra pure stérile (qsp 25 µl). Le milieu réactionnel a alors été soumis à 5 minutes à 95°C afin de faire éclater les bactéries pour libérer l’ADN, puis l’amplification génique s’est déroulée selon les 35 cycles suivants : 30 secondes de dénaturation à 95°C, 30 secondes d’hybridation à 50°C pour les gènes B646L et CP204L et 55°C pour le gène E183L, et une élongation de 30 secondes à 72°C pour tous les gènes. Une élongation finale de 7 minutes à 72°C a enfin été réalisée pour terminer la réaction.
Les produits d’amplification ont été visualisés après électrophorèse en gel d’agarose à 1% (Qbiogen) en TAE 1X et illumination au rayonnement UV. La taille des amplicons a été
contrôlée en regard d’un marqueur de poids moléculaire 100 pb (Biolabs). Les colonies positives, c’est-à-dire pour lesquelles la réaction d’amplification génique a produit un fragment d’ADN de la taille attendue, ont été sélectionnées afin d’être cultivées et multipliées afin de produire une large quantité de plasmide contenant les gènes ou fragments de gène d’intérêt qui serviront au séquençage. Les plasmides sont de fait plus faciles d’utilisation et permettent souvent un séquençage de meilleure qualité, notamment en ce qui concerne les extrémités de l’insert.
1-2-8- Préparation de l’ADN plasmidique
Chaque colonie bactérienne blanche sélectionnée a été cultivée dans 4 ml de milieu LB contenant 100 µg/ml d’ampicilline. Après une nuit d’incubation à +37°C et 250 t/m les cultures bactériennes ont été centrifugées à 5500 g pendant 15 minutes, et le surnageant de culture a été jeté. L’ADN plasmidique a alors été purifié au moyen du kit Pure Yield Plasmid Miniprep System (Promega), selon les instructions du fabriquant. L’ADN plasmidique purifié a été dosé par spectrophotométrie à 260 nm et son niveau de pureté contrôlé grâce au ratio des DO à 260 et 280 nm.
La présence et la qualité de l’insert présent dans les plasmides ont été contrôlées au moyen d’une digestion enzymatique par EcoRI, dont le plasmide pCR2®.1-topo contient deux sites qui flanquent le site d’insertion des produits PCR et permettent donc son relargage. Le milieu réactionnel contenait 500 ng de plasmide, 10 U d’enzyme EcoRI (Biolabs), 2 µl de tampon 10X et de l’eau ultra pure stérile (qsp 20 µl). Le mélange a été incubé pendant une heure à +37°C, puis les produits de digestion ont été visualisés après électrophorèse en gel d’agarose 1% (Qbiogen) en TAE 1X contre le plasmide non digéré. La taille des fragments d’ADN digérés a été contrôlée après illumination au rayonnement UV au moyen des marqueurs de poids moléculaire 100 pb et 1 kb.
1-2-9- Séquençage des gènes d’intérêt
La méthode qui a été appliquée pour le séquençage des gènes cibles est celle du Big Dye Terminator (ABI PRISM Big Dye Terminator, Perkin Elmer). Le principe de cette méthode est d’utiliser des nucléotides marqués et non marqués au cours de la réaction d’amplification génique. Lorsque les nucléotides marqués sont intégrés au fragment d’ADN néo-synthétisés, leur marquage a un effet terminateur de chaine, la polymérase ne pouvant plus accrocher le nucléotide suivant. Les nucléotides marqués ou non marqués étant recrutés au hasard par la polymérase, les fragments d’ADN générés par l’amplification seront donc de toutes tailles, et leurs extrémités détectables grâce au nucléotide marqué qui les termine. La détection de ce nucléotide final est faite au moyen du séquenceur automatique Perkin Elmer 377, et chaque base a été lue au moins deux fois, en utilisant des amorces
spécifiques du plasmide pCR2®.1-topo qui encadrent l’insert. Les nucléotides ont donc été lus une fois dans le sens 5’ 3’ et une fois dans le sens 3’ 5’.
Le milieu réactionnel contenait 600 à 800 ng d’ADN plasmidique, 5 µl de tampon Big Dye Reaction Mix, 1,7 µM d’une seule amorce, 0,75 µl de DMSO, 3 µl de tampon 5X et de l’eau ultra pure stérile (qsp 15 µl). L’amplification génique suivante a alors été réalisée : une dénaturation de 2 minutes à 95°C suivie de 25 cycles composés d’une dénaturation à 95°C pendant 10 secondes, une hybridation de 10 secondes à 50°C et une élongation de 4 minutes à 60°C. Les produits d’amplification ont alors été purifiés sur des colonnes de sépharose (Qbiogene), déshydratés dans un évaporateur et les culots d’ADN repris dans 5 µl d’un mélange bleu Dextran (Perkin Elmer) / formamide (1:5). Avant électrophorèse en gel de polyacrylamide (Cambrex), l’ADN a été dénaturé à 95°C pendant 5 minutes puis placé dans de la glace.
Les séquences ainsi produites ont été contrôlées au moyen du logiciel Vector NTI (Informax Inc.) en utilisant les électrophorégrammes générés par le séquenceur. Après vérification de chaque base, lue au moins deux fois, les fragments complets ont été assemblés. Les nouvelles séquences de gènes du virus PPA ont alors été téléchargées dans une base de données spécifique du virus PPA.
Parmi les 21 isolats malgaches que nous avons séquencés, 19 l’ont été selon cette méthode. Pour les deux derniers, Gara08 et Tsididy08, le séquençage a été externalisé et effectué par la société Beckman Coulter Genomics (Angleterre).
1-3- Création d’une base de données dédiée au virus PPA
Les bases de données publiques de séquences ADN sont rarement dédiées à un seul organisme et, si une telle base de données existe pour le virus Influenza aviaire dans GenBank, aucun outil de ce type n’était jusqu’ici disponible concernant le virus PPA. Nous avons donc créé une base de données permettant d’accueillir de façon exhaustive toutes les séquences disponibles du virus de la PPA. Cette base a été créée au format MySQL et est accessible par le biais d’internet via une adresse URL.
Cette base de données a été abondée de toutes les séquences disponibles dans les banques publiques (GenBank, EMBL, CISA-INIA) ainsi que des séquences que nous avons générées en propre. Douze champs d’informations ont été complétés pour chaque isolat, selon les informations disponibles dans les bases de données et les publications auxquelles elles font références. Ces 12 champs sont : le numéro d’accession, le nom, l’année, le pays, la région de prélèvement et le génotype de l’isolat, l’espèce animale sur laquelle le prélèvement a été effectué, le gène, la taille de la séquence nucléotidique, la séquence ADN, la séquence protéique traduite ainsi que la propriété hémadsorbante du virus.
La base de données a été construite pour sélectionner les isolats à étudier et générer les fichiers de sortie correspondant au format informatique « fasta ». Ces fichiers peuvent alors être directement utilisés dans nombre de logiciels de traitement et d’analyse de séquences.
Au total 361 séquences du gène B646L, 252 séquences du gène E183L et 129 séquences du gène CP204L ont été téléchargées dans la banque de données en ce qui concerne les gènes cibles que nous avons utilisés dans cette étude.
2- Comprendre les relations qui unissent les isolats viraux : analyse approfondie de