Données complémentaires à l’article

Les sous-chapitres 1.3.1. et 1.3.2. présentent des résultats qui ont été cités comme « data not shown » dans l’article 1. Les deux sous-chapitres suivant décrivent des résultats concernant le profil d’expression de AtTOR.

1.3.1 Phénotype du mutant tor-2

La figure 34 présente le phénotype du mutant tor-2. Une silique hétérozygote pour la mutation tor-2 produit un quart de graines avortées (Fig. 34A ; article 1). Des observations en microscopie Nomarsky montrent que le développement de l’embryon est arrêté au stade globulaire comme pour le mutant tor-1 (comparez les Fig. 34 E-G avec les Fig. 4B-C de l’article 1).

1.3.2 Absence de phénotype chez les mutants tor-1 et tor-2 hétérozygotes

Des plantes adultes hétérozygotes pour les mutations tor-1 et tor-2 ont été photographiées à côté de plantes sauvages du même âge, cultivées dans les mêmes conditions (Fig. 35). On peut observer que les deux mutants hétérozygotes ont une taille et une morphologie similaire aux plantes sauvages. De plus, aucun retard de floraison n’est observé. Seule l’observation des siliques disséquées permet de distinguer les plantes hétérozygotes pour les mutations tor1 et tor- 2 des sauvages. Cela montre que ces mutations sont récessives.

1.3.3 Profil d’expression de AtTOR après traitements par des phytohormones

Les plantes hétérozygotes TOR/tor-1 qui contiennent la fusion AtTOR::GUS ont été utilisées pour analyser le profil d’expression de AtTOR en réponse à des phytohormones (Fig. 36). Les hormones ayant le plus d’effet sur l’expression de AtTOR sont le 2,4D (une auxine) et la zéatine (une cytokinine). L’auxine induit l’expression de AtTOR dans les tissus vasculaires des racines au bout de 24 h de traitement. Après 72 h, l’expression de AtTOR devient restreinte aux méristèmes des nombreuses racines latérales induites par l’auxine. Par contre, la cytokinine induit l’expression de AtTOR au niveau du méristème apical caulinaire mais inhibe son expression au niveau des racines (phénomènes visibles après 72 h). Ces effets de ces deux hormones sur l’expression de AtTOR sont similaires à ceux décrits avec des gènes du cycle cellulaire et reflètent la compétence pour la prolifération au niveau des méristèmes (Hemerly et al., 1993 ; Ferreira et aI., 1994 ; Doerner et al, 1996 ). Ainsi, les hormones testées n’induisent pas l’expression de AtTOR dans des tissus où il n’est pas exprimé sans traitement, comme les

Figure 34 : phénotype du mutant tor-2. A, silique disséquée d’un mutant tor-2

hétérozygote. B à G, graines d ’une même silique de l’hétérozygote observées en microscopie Nomarski. B à D, graines normales. E à G, graines avortées. D et G sont des grossissements de C et F respectivement. Barre, 20 µm.

B C D

E F G

TOR/tor-1

Figure 35 : absence de phénotype apparent chez les plantes hétérozygotes pour les mutations tor-1 et tor-2. Deux plantes de chaque lignée, âgées de 44 jours, cultivées dans les

mêmes conditions, ont été placées côtes à côtes pour comparaison. Etant donné que les plantes mutantes proviennent de semis de graines issues de l’hétérozygotes, non sélectionnées sur kanamycine, l’hétérozygotie a été vérifiée par observation de graines avortée dans les siliques.

TOR/tor-2 sauvage

contrôle (éthanol DMSO) 2,4D 10-7 _M (auxine) ABA 10-7 _M (acide absi- ssique) Zeatine 10-6 _M (cyto- kinine) 24 h GA3 10-5 _M (gibbér- elline) 120 h durée du traitement (t)

Figure 36 : profil d’expression de AtTOR après traitements avec des phytohormones. Les

plantes heterozygotesTOR/tor-1 contenant la fusion AtTOR::GUS ont été utilisées. Des plantules ayant poussé pendant 10 jours sur un milieu H/2 à 0,7 % d’agar ont été transférée (t = 0h) sur milieux H/2 à 0,5 % d’agar (de sorte que les racines pénètrent bien le milieu) contenant l’hormone indiquée diluée dans un mélange d’éthanol (10%) et de diméthyl sulfoxide (DMSO, 10%). Les plantes ont ensuite été prélevée au temps indiqué puis traitées au colorant GUS. Barre, 1 mm.

feuilles adultes par exemple, mais induisent simplement une expression de AtTOR dans les méristèmes qu’elles activent. Cependant, cela n’exclut pas un contrôle post-traductionnel de l’activité de AtTOR par les hormones.

1.3.4 Suivi de l’ARNm de AtTOR

La fusion traductionnelle entre AtTOR et GUS présente dans le mutant tor-1 a permis d’analyser le profil d’expression de AtTOR résultant à la fois des régulations transcriptionnelles et traductionnelles. Afin d’étudier les éventuelles régulations transcriptionnelles de l’expression de AtTOR, les ARNm de AtTOR ont été analysés avec la méthode de northern. Plusieurs essais ont été réalisés, dans un premier temps avec des ARN totaux extraits à partir de différents tissus et de cultures cellulaires d’Arabidopsis, puis par la suite, à partir d’ARN polyA+ purifiés. Aucune bande n’a pu être détectée, même avec une ribosonde (sonde ARN) sur des ARN polyA+ purifiés à partir d’une culture cellulaire (résultat non présenté). Pourtant, la culture cellulaire a été choisie car c’est le type de cellules dans lequel nous avions le plus de chances de détecter l’ARNm de AtTOR, puisqu’il s’agit de micro-cals en suspension et que les cals hétérozygotes TOR/tor-1 présentent une forte coloration GUS ( Axelos et al., 1992 ; article 1, Fig. 5). Cette impossibilité de détecter l’ARNm de AtTOR par la méthode de northern indique que la quantité de transcrits de ce gène est faible. De même, l’ARNm de AtATM, un autre membre de la famille des PI3-K est très difficile à détecter par la méthode de Northern (Garcia et al., 2000).

Etant donné que nous n’avons pas réussi à détecter l’ARNm de AtTOR par transfert de northern, nous avons utilisé la méthode de RT-PCR semi-quantitative qui est plus sensible (Fig. 37). Le gène ACT8 codant l’Actine-8 a été utilisé comme contrôle car il est exprimé constitutivement chez Arabidopsis (An et al., 1996). Cette RT-PCR montre que le transcrit de AtTOR est exprimé dans tous les tissus d’Arabidopsis, même ceux ou le GUS n’est pas détectable (Fig. 37A ; article 1, Fig. 5). Cependant, AtTOR est exprimé à un niveau nettement plus faible que ACT8 puisque 4 cycles de PCR supplémentaires (ce qui équivaut à un facteur 16) avec les amorces TORsq sont nécessaires pour obtenir des bandes de la même intensité qu’avec les amorces ACT8 (comparez les Fig.37 A et B).

A, AtTOR