MATERIEL ET METHODES
2 Conditions de culture et transformations génétiques 1 Conditions de culture et transformation des bactéries
2.1.1 Conditions de culture des bactéries
E. coli est cultivée à 37°C dans le milieu de Luria Bertani (LB) contenant de l’extrait de levure (5 g/l), du bacto-tryptone (10 g/l) et du NaCl (5 g/l). De l’agar à 15 g/l est ajouté pour le milieu solide.
A. tumefaciens est cultivée dans les mêmes conditions que E. coli à l’exception de la température qui est de 3O°C au lieu de 37°C.
Les antibiotiques dont le gène de résistance est apporté par le plasmide sont utilisés aux concentrations suivantes pour sélectionner les bactéries transformées : ampicilline 100 µg/ml, kanamycine 50 µg/ml.
2.1.2 Transformation des bactéries
Une culture (500 ml ou 1l) de la souche appropriée est réalisée à 37°C (30°C pour Agrobacterium) jusqu’à obtention d’une DO600 de 0,6. Les cellules sont alors refroidies dans la glace, lavées deux fois dans du glycérol 10 % puis le culot est resuspendu doucement dans un volume minimal (1 à 2 ml) de glycérol 10 % froid. Les bactéries sont alors aliquotées par 50 µl, congelées dans l'azote liquide et conservées à -80°C. L’efficacité des bactéries (généralement 107 transformants/µg d'ADN) est testée par transformation avec un plasmide de concentration connue. Pour la transformation, les bactéries électrocompétentes sont décongelées lentement et maintenues à 4°C. Le produit de ligature (4 µl) est mélangé aux bactéries dans des cuves à
Fig. 43 : carte du plasmide pCR-XL-TOPO (Invitrogen) utilisé pour le clonage de l’ADNc
de AtTOR. La flèche bleue indique l’orientation de la séquence codante de AtTOR clonée. Le site de réstriction utilisé pour le sous-clonage est entouré en rouge.
Fig. 44 : carte du plasmide pBluescript (Stratagene) utilisé pour le clonage et la transcription
de la ribosonde. Le site de réstriction utilisé pour le clonage est entouré en rouge
Ampicilline
lacZ
Origine de réplication
Fig. 45 : carte des plasmides pBI771 (A) et pBI880 (B) utilisés pour le double hybride. ADC1 : gène de l’Alcool dehydrogénase I. ARS/CEN6 ; séquence autonome de réplication et séquence centromériques, pour la réplication dans la levure. Ori : origine de réplication
bactérienne. Les sites de restriction soulignés sont uniques. Les sites de réstriction utilisés
pour les clonages sont entourés en rouge. D ’après Kohalmi et al., 1997.
ampicillline Promoteur ADC1 Promoteur ADC1 Terminateur ADC1 Terminateur ADC1 TRP1 LEU2 GAL4(BD) GAL4(AD) A B ampicillline ARS/CEN6 ARS/CEN6 ori ori
Fig. 46 : carte des plasmides pRT et pGPTV utilisés pour la transformation
d’Arabidopsis. Les constructions sont réalisées dans les plasmides pRT-35S ou pRT-UAS, puis insérées dans pGPTV en utilisant l ’enzyme AscI Les sites de réstriction utilisés pour les clonages sont entourés en rouge. D ’après Überlacker et Werr, 1996. pRT-UAS a été créé et fourni par Thierry Desnos (LMV, DEVM, CEA Cadarache). Xba I Sal I Hind III pRT-35S (résistance à l ’ampicilline) pGPTV
Résistances : kanamy cine (bactéries) l ’hygromycine (plantes) pRT-UAS (résistance à l ’ampicilline) Hind III EcoR V UAS
73 électroporation et le courant électrique est appliqué (12,5 kV, 200 Ω, 25 µF). Les bactéries sont reprises dans 1 ml de milieu LB et placées à 37°C (ou 30°C) sous agitation pendant 1 h puis étalées sur des boîtes de milieu LB contenant l’antibiotique adéquat.
2.2 Condition de culture et transformation des levures
2.2.1 Conditions de culture des levures
La souche de levure SMY-87-4 est cultivée dans le milieu riche YPD (Extrait de levure 10 g/ bacto-pectone 20 g/l, glucose 20 g/l et adénine hémisulfate 30 mg/l ; Ausubel et al., 1993) jusqu transformation. Après transformation, les levures sont sélectionnées sur milieu minimum [1,7 g/L d YNB-AA/AS (milieu pour levure sans aminoacides et sulfate d'ammonium), 5 g/l de (NH4)2SO4 et 2 g/L de dextrose] complété avec tous les aminoacides sauf la leucine, l’uracile et le tryptophan Enfin, les expériences de double hybride sont réalisées sur le milieu minimum dépourvu de leucin d’uracile, de tryptophane et d’adénine.
2.2.2 Transformation génétique des levures
Les levures sont cultivées dans du milieu YPD jusqu'à obtention d'une DO600 de O,7. Elles sont alors lavées deux fois à l'eau stérile puis reprises dans de l'acétate de lithium (LiAc) 0,1M (1/100 du volume initial). Après incubation à 30°C (15 min), 50 µl de levures sont mélangés avec les 3 plasmides (0,5 µg de chacun ) et 50 µg d'ADN de sperme de saumon soniqué (dénaturé 5 min à 100°C avant emploi), puis 300 µl de PEG/LiAc (40 % Polyéthylène glycol 3350, 0,1M LiAc) sont ajoutés. L'échantillon est alors incubé 30 min à 42°C, puis centrifugé et resuspendu dans de l'eau et étalé sur boîtes sélectives pendant 3 jours à 30°C.
2.3 Conditions de culture de Chlamydomonas
Chlamydomonas reinharditii a été cultivée à 25°C dans le milieu TAP (Tris-Acetate- Phosphate) contenant de l'acétate comme source de carbone (Harris, 1989). Pour le test de sensibilité à la rapamycine, 1 unité de DO600 de culture a été centrifugée (3000 g, 4min) et resuspendue dans du Top agar (0,7 % agar à 40°C) puis étalée sur une boîte de pétri contenant du milieu TAP solide (15 g/l d'agar).
2.4 Conditions de culture des plantes et transformation génétique
2.4.1 Conditions de culture d’Arabidopsis thaliana
Pour la culture in vitro, la surface des graines est stérilisée 7 minutes dans une solution 9:1 éthanol 95 % et de Bayrochlore™ (BAYROL, dissolution d'une pastille dans 40 ml d'eau),
rincées deux fois à l'éthanol 95 %, puis séchées sous hotte à flux laminaire. Les graines sont semées en boîtes de pétri contenant du milieu de culture Hoagland/2 (1 mM MgSO4, 2 mM Ca(NO3)2, 1.7 mM KNO3, 0.5 mM NH4H2PO4, 1.6 µM Fe, 46.2 µM H3BO3, 9.1 µM MnCl2, 0.87 µM ZnSO4, 0.32 µM CuSO4, 1.03 µM Na2MoO4 ; Arnon et Hoagland, 1940). Les semis sont placés 48 heures à 4°C afin de synchroniser la germination, puis en chambre de culture avec une photopériode de 16 heures jour / 8 heures nuit, une température de 20°C jour/15°C nuit et une humidité relative de 70 %. Le transfert des boîtes de Pétri en chambre de culture correspond au jour 0 de croissance.
Les cultures en sol ont été réalisées en phytotrons sur terreau stérilisé, éclairée selon une photopériode de 16 heures de jour à 23°C et 8 heures de nuit à 17°C et irriguées avec une solution nutritive.
2.4.2 Conditions de culture des autres plantes
Les graines de tomate, de colza, de riz et de tabac ont été semées in vitro sur milieu Gamborg B5 (SIGMA G5768) qui correspond au milieu de Murashige et Skoog (1962) additionné de myo-inositol (100 mg/l), de thiamine (10 mg/l), de pyridoxine (1 mg/l), d’acide nicotinique (1 mg/l), de MES pH 7,5 (0,5 g/l) et de d’agar (0,7 %) (Gamborg et al. , 1968).
2.4.3 Transformation génétique d’Arabidopsis par Agrobacterium tumefaciens
Les plantes, cultivées en serre, âgées d'environ trois semaines (premières siliques développées) sont transformées in planta par trempages des inflorescences dans la solution de d'Agrobacterium transformées avec le plasmide contenant l'ADN-T à transférer et resuspendue dans une solution de MgCl2 10 mM, saccharose 5 % et silwett 77 (50 µl/l) (Clough et Bent, 1998). Après traitement, les plantes (T0) sont placées dans un sac plastique pendant deux ou trois jours afin d'éviter la déshydratation et de favoriser la pénétration des bactéries. Après 6 à 8 semaines de culture, la descendance de ces plantes (T1) est récoltée. La surface des semences est stérilisée avant semis in vitro. Les transformants sélectionnés sur hygromycine (30 µl/l) sont ensuite transférés en serre. Les semences (T2) issues de l'autofécondation des plantes T1 sont utilisées pour les différentes analyses.
2.5 Phytohormones et rapamycine
L'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D ; Sigma D8407), l'acide (+/-)-cis, trans-abscissique (ABA, Sigma A1049) et l'acide gibbérellique A3 (GA3, Sigma G7645) et la
75 zéatine (Sigma Z0750) sont ajoutées au milieu à partir de solution mère conservées à –20 °C dans de l'éthanol.
La rapamycine (SIGMA R0395) est utilisée à partir d’une solution à 1 µg/ul dans un mélange d’éthanol (90 %) et de tween 20 (10 %) qui est stockée à – 20°C.