Diversité génétique des bactéries sélectionnées

4.3.6.1. Caractérisation des souches isolées à l’aide des données moléculaires de l’ADNr 16S

Une importante diversité génétique a été isolée au contact des racines de

Costularia. Parmi la collection de 112 souches bactériennes, 92 souches

appartenant à 14 genres, ont pu être caractérisées à l’aide des données moléculaires de l’ADNr 16S (données complètes : Tableau 4.5 et 4.6). Quarante sept

souches, réparties en 11 genres, proviennent de la rhizosphère de C. arundinacea et

40 souches, réparties en 14 genres, de celle de C. nervosa (Tableau 4.7). Les résultats indiquent que les genres les plus fréquents sont représentés par

Bradyrhizobium (31,1%), Burkholderia (22,8%), Curtobacterium (11,8%),

Pseudomonas (5,9%) et Sphingomonas (5,6%) (Tableau 4.7). La distribution des

deux genres dominants, Bradyrhizobium et Burkholderia ne montre pas de différence

significative (test de Kruskal-Wallis) entre les deux espèces et les quatre sites échantillonnés (données synthétiques : Fig 4.2). De même la distribution du genre

Curtobacterium est homogène entre les deux espèces, mais ce genre n’est pas

identifié au sein du site 4 de Plum.

4.3.6.2. Caractérisation moléculaire des souches tolérantes au nickel Parmi les 92 isolats caractérisés, 69 souches appartenant à 11 genres sont

résistantes à 1 mM de nickel (Bradyrhizobium, Burkholderia, Curtobacterium,

Pseudomonas, Sphingomonas, Micrococcus, Methylobactérium, Serratia,

Acinetobacter, Pantoea et Azorhizobium). Soixante de ces souches résistent

également à 3 mM de nickel, elles sont représentées par les mêmes genres que précédemment. Enfin, 25 souches résistent également à 15 mM. Ces dernières sont

représentées par les genres Burkholderia (14 souches), Bradyrhizobium (4 souches),

Curtobacterium (3 souches), et Sphingomonas, Pseudomonas, Serratia et Pantoea

Tableau 4.5. Résultats par Blast-N des analyses de séquences partielles de la petite SU 16S de l’ADNr de Costularia arundinacea

Genre Espèce ^Accession

number Total score Query coverage ^{E value} max ID Site 4 FZ 667 Acinetobacter A. calcoaceticus FJ263920.1 1175 99% 0.0 99% Site 4 FW 635 Aurantimonas A. altamirensis EU697964.1 1007 100% 0.0 95% Site 4 AH 630 Bradyrhizobium B. japonicum BA000040.2 325 59% 1,00E-85 70% Site 2 IT 656 Bradyrhizobium B. japonicum FJ784890.1 1095 99% 3,00E-156 98% Site 2 X 1391 Bradyrhizobium B. japonicum FJ436370.1 2489 100% 0.0 99% Site 4 BB 1418 Bradyrhizobium B. japonicum AY904765.1 2488 99% 0.0 99% Site 3 BO 714 Bradyrhizobium B. japonicum FJ025099.1 1256 99% 0.0 99% Site 4 IN 624 Bradyrhizobium B. liaoningense FJ418695.1 1108 100% 0.0 99% Site 4 AM 666 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. FJ418929.1 1180 100% 0.0 99% Site 4 AW 198 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. FJ687965.1 338 100% 5,00E-90 98% Site 4 AX 272 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. FJ193314.1 473 97% 2,00E-130 99% Site 1 DA 788 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. FJ418929.1 1202 86% 0.0 98% Site 3 GF 652 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. FJ687962.1 1122 96% 0.0 99% Site 2 HE 629 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. EU364706.1 1104 99% 0.0 99% Site 4 IR 622 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. FJ687962.1 1108 100% 0.0 99% Site 2 IJ 643 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp. AY528712.1 1117 99% 0.0 99% Site 1 AD 857 Burkholderia B. cepacia AY741358.1 1204 96% 0.0 98% Site 1 HH 250 Burkholderia B. phymatum CP001044.1 419 100% 3,00E-114 97% Site 2 AB 676 Burkholderia Burkholderia sp. FJ434110.1 1196 100% 0.0 99% Site 1 AE 475 Burkholderia Burkholderia sp. FJ025138.1 767 98% 0.0 97% Site 2 AF 676 Burkholderia Burkholderia sp. AY178062.1 1076 96% 0.0 97% Site 2 G 681 Burkholderia Burkholderia sp. EU477797.1 1110 98% 0.0 97% Site 1 HG 695 Burkholderia Burkholderia sp. EF149008.1 1076 91% 0.0 97% Site 2 HK 674 Burkholderia Burkholderia sp. FJ434110.1 1157 99% 0.0 98% Site 3 ID 728 Burkholderia Burkholderia sp. EF149008.1 1097 98% 0.0 94% Site 1 D 865 Burkholderia Burkholderia sp. AF247494.1 1204 80% 0.0 97% Site 1 E 1413 Curtobacterium C. citreum AM410690.1 2488 100% 0.0 99% Site 1 B 779 Curtobacterium Curtobacterium sp. EU741027.1 1227 87% 0.0 99% Site 3 BQ 818 Curtobacterium Curtobacterium sp. EU741027.1 1234 84% 0.0 99% Site 3 DQ 663 Curtobacterium Curtobacterium sp. EU741027.1 1186 99% 0.0 99% Site 4 ES 644 Curtobacterium Curtobacterium sp. EU741027.1 1150 99% 0.0 99% Site 3 FN 810 Curtobacterium Curtobacterium sp. EU741027.1 1198 82% 0.0 99% Site 1 L 756 Curtobacterium C. albidum AM410691.1 1364 100% 0.0 100% Site 1 DJ 653 Methylobacterium M. komagatae FJ786402.1 1074 95% 0.0 98% Site 1 DL 500 Methylobacterium M. variabile AB302931.1 832 100% 0.0 96% Site 2 DE 648 Methylobacterium Methylobacterium sp.FJ006916.1 1095 97% 0.0 98% Site 1 DZ 648 Micrococcus M. luteus FJ816022.1 1144 100% 0.0 99% Site 1 EE 621 Micrococcus M. luteus EU379294.1 1047 99% 0.0 98% Site 1 EL 674 Pantoea Pantoea sp. EU780667.1 1160 99% 0.0 98% Site 1 GS 654 Pantoea Pantoea sp. FJ611863.1 1121 99% 0.0 98% Site3 HW 617 Pantoea Pantoea sp. FJ611863.1 1040 100% 0.0 97% Site 2 CU 714 Pseudomonas Pseudomonas sp. FJ719357.1 1272 99% 0.0 99% Site 1 DB 663 Pseudomonas Pseudomonas sp. FJ786068.1 1189 99% 0.0 99% Site 1 J 385 Pseudomonas Pseudomonas sp. EU781733.1 634 97% 1,00E-178 98% Site 4 EV 647 Sphingomonas S. mali FJ772027.1 1135 99% 0.0 99% Site 1 EN 1396 Sphingomonas S. yunnanensis AY894691.1 2443 99% 0.0 99% Site 3 FR 629 Sphingomonas S. yunnanensis EU730917.1 1124 99% 0.0 99% Site 4 AL 656 Sphingomonas Sphingomonas sp. EU723093.1 1067 99% 0.0 96% Site 3 FE 798 Williamsia W. serinedens AM283464.1 1184 83% 0.0 99% Site 3 FF 400 Williamsia W. serinedens AM283464.1 719 99% 0.0 100%

Site ^Réf.

souche

Partial 16S (pb)

Tableau 4.6. Résultats par Blast-N des analyses de séquences partielles de la petite SU 16S de l’ADNr de Costularia nervosa

Genre Espèce ^Accession

number Total score Query coverage ^{E value} max ID Site 4 IQ 592 Acinetobacter A. calcoaceticus EU921459.1 904 100% 0.0 94% Site 1 CW 694 Acinetobacter Acinetobacter sp. FJ560466.1 1220 100% 0.0 99%

Site 4 AQ 681 Azorhizobium Azorhizobium sp. EU876663.1 994 93% 0.0 95%

Site 1 CT 559 Bradyrhizobium B. elkanii FJ796454.1 993 98% 0.0 100%

Site 2 DP 330 Bradyrhizobium B. japonicum BA000040.2 292 98% 1,00E-57 77%

Site 2 S 380 Bradyrhizobium B. japonicum FJ84890.1 645 100% 0.0 98%

Site 4 AT 630 Bradyrhizobium B. japonicum EU481826.1 1117 99% 0.0 99%

Site 3 BR 458 Bradyrhizobium B. liaoningense FJ418695.1 765 97% 0.0 98% Site 2 AG 641 Bradyrhizobium B. yuanmingense FJ540938.1 1216 100% 0.0 100% Site 4 AK 601 Bradyrhizobium B. yuanmingense FJ785218.1 1058 99% 0.0 99% Site 4 AP 674 Bradyrhizobium B. yuanmingense FJ540938.1 1216 100% 0.0 100% Site 1 GY 756 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp.AB367699.1 1344 99% 0.0 99% Site 1 M 400 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp.FJ193499.1 697 100% 0.0 99% Site 3 BT 652 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp.AM179839.1 1122 97% 0.0 99% Site 3 GJ 620 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp.FJ418929.1 1106 99% 0.0 99% Site 4 IS 389 Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp.FJ555232.1 621 98% 7,00E-175 95%

Site 2 P 676 Burkholderia B. cepacia AY741358.1 1092 94% 0.0 98%

Site 1 EM 650 Burkholderia B. sediminicola EU035613.1 1137 100% 0.0 98% Site 1 AC 430 Burkholderia Burkholderia sp. EU184087.1 756 100% 0.0 99%

Site 1 N 706 Burkholderia Burkholderia sp. FJ422401.1 1160 95% 0.0 98%

Site 2 DF 684 Burkholderia Burkholderia sp. AY178062.1 1110 95% 0.0 98% Site 2 IK 1161 Burkholderia Burkholderia sp. AF247494.1 1331 82% 0.0 94%

Site 2 Y 676 Burkholderia Burkholderia sp. FJ025138.1 1110 96% 0.0 98%

Site 3 HX 674 Burkholderia Burkholderia sp. FJ434110.1 1157 99% 0.0 98% Site 3 IF 690 Burkholderia Burkholderia sp. EF149008.1 1097 95% 0.0 97% Site 4 IC 657 Burkholderia Burkholderia sp. AY178058.1 1137 100% 0.0 98%

Site 2 FD 649 Curtobacterium C. citreum FJ823008.1 1150 98% 0.0 99%

Site 2 U 643 Curtobacterium C. citreum FJ823008.1 1119 99% 0.0 99%

Site 1 EO 410 Curtobacterium Curtobacterium sp.FJ388230.1 731 100% 0.0 99% Site 2 CV 1071 Curtobacterium Curtobacterium sp.EU741027.1 1479 89% 0.0 98% Site 4 ES 644 Curtobacterium Curtobacterium sp.EU741027.1 1150 99% 0.0 99%

Site 4 IV 631 Micrococcus M. luteus FJ816022.1 1139 100% 0.0 100%

Site 3 FI 470 Microlunatus M. panaciterrae AB271051.1 805 98% 0.0 98%

Site 3 BS 780 Pantoea Pantoea sp. EU780667.1 1219 98% 0.0 98%

Site 4 IL 671 Pseudomonas P. fulva FJ807483.1 1198 99% 0.0 99%

Site 2 CY 410 Pseudomonas P. moorei FM955889.1 710 100% 0.0 99%

Site 2 CZ 1059 Pseudomonas Pseudomonas sp. FJ719357.1 1546 86% 0.0 98%

Site 4 HR 687 Roseomonas R. gilardii AY220740.1 939 86% 0.0 94%

Site 4 AS 666 Serratia S. marcescens AB272355.1 1166 100% 0.0 98%

Site 3 FG 640 Sphingomonas S. yunnanensis EU730917.1 1150 99% 0.0 100%

Site 2 FC 641 Williamsia W. serinedens AM283464.1 1135 100% 0.0 99%

Réf. souche Partial 16S (pb) Site

Figure 4.2. Structure des populations de rhizobactéries isolées au contact des racines de C. arundinacea et C. nervosa, fréquence des principaux genres identifiés

Tableau 4.7. Nombre de bactéries appartenant aux 15 genres bactériens identifiés au sein des racines des deux espèces de Costularia prélevées dans 4 sites de maquis

4.3.6.2. Recherche de la présence de déterminants moléculaires par amplification des gènes de résistance au nickel nreB et cnrA

Les résultats indiquent que sur les 84 souches isolées aptes à pousser sur un milieu contenant 1 mM de nickel, 22 souches présentent une amplification de la séquence cnrA, 6 une amplification de la séquence nreB, 16 présentent les deux amplifications et 40 souches ne présentent aucune amplification avec ces deux couples d’amorces. Aucune corrélation significative n’est obtenue entre la détection moléculaire des déterminants de résistance et les résultats de tolérance au nickel en milieu de culture (Tableau 4.4). En effet, les trois combinaisons de marqueurs moléculaires, nreB seul, cnrA seul et nreB couplé à cnrA, sont identifiées comme capable de résister à des concentrations supérieures à 15 mM de nickel (Tableau 4.4). Il apparaît également que toutes les souches possédant les deux déterminants (nreB et cnrA) résistent à plus de 3 mM de nickel soluble. Les résultats indiquent

également que 65% des souches de Bradyrhizobium et 80% des souches de

Burkholderia présentent soit nreB, soit cnrA, soit les deux déterminants de résistance et que parmi ces deux genres, certaines souches résistantes au nickel ne possèdent aucun de ces deux déterminants de résistance.

4.4. Discussion

4.4.1. Densité des populations de rhizobactéries sur sols