Discussion

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La littérature suggère que l’activation de S1PR1 joue un rôle protecteur dans l’asthme. L’administration locale d’un agoniste spécifique de S1PR1, CYM-5442, inhibe l’inflammation dans un modèle d’asthme murin [89] mais les cellules cibles et les mécanismes sont inconnus. Les CE bronchiques sont les premières cellules en contact avec le traitement et elles sont dysfonctionnelles dans l’asthme. Elles constituaient donc des cibles potentielles pour CYM-5442. Ce projet démontre que les CE bronchiques primaires de rats expriment la protéine S1PR1 (fig. 5A et fig. 6), De plus, nous avons démontré que la protéine S1PR1 semble être surexprimée dans les CE bronchiques d’un modèle d’asthme (fig. 5B, C). Nos données montrent également que la protéine S1PR1 est exprimée dans des lignées de CE pulmonaires humaines. Ainsi notre model murin semble être représentatif de l’humain puisque nos données préliminaires suggèrent que l’expression de S1PR1 pourrait également être modulée dans des CE humaines primaires dans le contexte de l’asthme (fig. 7B). De manière importante, nos résultats supportent que l’activation de S1PR1 de manière pharmacologique pourrait interférer avec des mécanismes impliqués dans l’asthme dont la libération de facteurs inflammatoires et la perte d’étanchéité de la barrière.

Très exprimée dans les cellules endothéliales, l’expression de la protéine S1PR1 n’avait jamais été évaluée dans les CE bronchiques. Une méthode de détection et de quantification a dû être développée dans ce projet de recherche. Plusieurs caractéristiques de cette protéine ont rendu cette tâche complexe. La protéine S1PR1 est souvent glycolisée ou polyubiquitinylée, ce qui a comme conséquence d’augmenter le poids moléculaire du récepteur, constituant ainsi un facteur confondant lors de la détection en immunobuvardage de western [122]. La glycolisation de S1PR1 pourrait expliquer la différence de poids moléculaire qui été observé lors des immunobuvardages de western (fig. 5). De plus, la protéine S1PR1 forme des homodimères et des hétérodimères avec d’autres récepteurs, ce qui augmente la présence de doublets et diminue son expression monomérique [123]. Lors de la mise au point de la détection en immunobuvardage de western, nous avons observé que la dénaturation de la protéine avec du tampon de lyse frais et l’exposition des tubes de lysats à de l’eau bouillante réduisait le poids moléculaire de S1PR1 et permettait sa détection à 46 kDa, le poids moléculaire de référence de la protéine. De plus, l’ajout de DTT au tampon de chargement a permis la réduction de doublets.

55 L’utilisation d’une deuxième méthode de détection nous a permis de caractériser la localisation de S1PR1 dans les CE bronchiques de rats. Des marquages en immunofluorescence avec le même anticorps qu’en immunobuvardage de western ont montré la présence d’une protéine exprimée à la surface cellulaire ainsi qu’aux jonctions intercellulaires (fig. 6). Cette localisation cellulaire correspond à celle de S1PR1 dans les cellules endothéliales [105]. Les résultats obtenus à l’aide de ces deux méthodes semblent confirmer la présence de S1PR1 de même que sa surexpression dans les CE bronchiques de rats et humaines.

Malgré l’utilité des études in vitro, il sera important de confirmer que la protéine S1PR1 est bel et bien surexprimée in situ pour confirmer que la surexpression de S1PR1 n’est pas un artéfact associé à la culture de CE bronchiques puisque cette surexpression de S1PR1 n’a jamais été constatée in vivo. Des analyses histologiques pourront également être effectuées pour confirmer cette surexpression dans les CE bronchiques dans notre modèle. Cependant, les résultats d’une étude génétique qui étudie l’expression de S1PR1 dans l’asthme abondent dans le même sens que les données que nous avons obtenues. L’expression d’un polymorphisme du gène S1PR1 est associée au développement de l’asthme chez les Caucasiens et les Afro-américains [9]. Donc, pour le moment, nos résultats semblent montrer pour la première fois que la protéine S1PR1 est exprimée dans les CE bronchiques primaires de rats et humaines. La surexpression de S1PR1 dans des CE bronchiques de patients asthmatiques, qui n’avait jamais été identifié auparavant, suggère un rôle de S1PR1 dans l’épithélium des asthmatiques. Puisque l’activation pharmacologique de S1PR1 par un agoniste spécifique réduit l’inflammation dans l’asthme, nous spéculons que la surexpression de S1PR1 est un mécanisme de protection dans l’asthme qui pourrait être associé au renversement de dysfonctions épithéliales.

Nos résultats supportent que l’activation pharmacologique de S1PR1 sur les CE bronchiques pourrait, du moins en partie, contribuer à l’effet anti-inflammatoire observé suivant l’administration locale d’agoniste du récepteur S1PR1 in vivo en réduisant la

perméabilité paracellulaire et en réduisant la libération de chimiokines induites par des cytokines proinflammatoires. Tout d’abord, nous avons montré que les ABEC étaient significativement plus perméables que les NBEC (fig. 8). Ces résultats sont semblables à ceux obtenus par l’équipe du Dre Bissonnette [communication personnelle]. Ces résultats suggèrent une dysfonction similaire à celle observée dans les CE humaines dans l’asthme [28].

Les résultats obtenus par les essais de perméabilité avec des CE bronchiques de notre modèle d’asthme montrent que la perméabilité des ABEC tend à diminuer à des doses physiologiques de CYM-5442 (fig. 8). Ces résultats divergent de ceux de Milara et al. [62] qui montrent que la S1P (1E-05 M), qui active tous les S1PRs, induit de la TEM, phénotype qui est associé à une augmentation de la perméabilité paracellulaire, dans une lignée de CE pulmonaires, les A549. Cependant, les doses utilisées pour démontrer l’induction de TEM par l’activation de S1PR1 ne représentent pas des doses physiologiques. L’utilisation de doses élevées de S1P est associée à des effets non spécifiques comme l’induction d’apoptose et même de l’antagonisme fonctionnel. De plus, la présence de TEM dans ce modèle est associée à l’activation de S1PR2 et S1PR3 tandis que celle de S1PR1 ne semble pas impliquée dans ce phénomène. Nos résultats supportent ainsi que l’activation spécifique de S1PR1, par des doses physiologiques de CYM-5442, est plutôt associée à une augmentation de l’étanchéité de la barrière épithéliale dans les CE bronchiques. La modulation de S1PR1 a des effets similaires dans les lignées de cellules humaines et de rats en regard de la modulation de la perméabilité. Tel qu’observé dans les essais de perméabilité, l’activation de S1PR1 par CYM-5442 pourrait augmenter l’étanchéité paracellulaire des BEAS-2B puisque le traitement induit des anneaux corticaux d’actines polymérisées autour des cellules (fig. 9). Ces résultats sont similaires à ceux obtenus par Garcia et al. qui montrent que la S1P induit également des anneaux corticaux d’actine polymérisée autour de cellules endothéliales bovines [84]. Des tests de perméabilité sur de CE bronchiques primaires de sujets asthmatiques devront également être effectués pour associer ces changements cellulaires à une modification fonctionnelle.

57 Nos résultats montrent également une implication de S1PR1 dans la régulation d’une autre dysfonction importante des CE bronchiques dans l’asthme, la surproduction de médiateurs solubles. L’activation spécifique de S1PR1 par CYM-5442 réduit significativement la libération de CCL2 par les CE bronchiques d’un modèle d’asthme dans un contexte proinflammatoire (fig. 11D). Lorsqu’on compare l’effet de CYM-5442 à AAL-R (fig. 11B), qui lorsque phosphorylé possède des effets anti-inflammatoires in vivo [74], les résultats suggèrent que l’activation spécifique de S1PR1 est suffisante pour réduire la libération de CCL2 dans un contexte proinflammatoire. L’agoniste spécifique de S1PR1, CYM-5442, représente donc une meilleure alternative pour réduire la libération de chimiokines qu’AAL-R qui est associé à de nombreux effets non spécifiques qui ne sont pas liés à l’activation de S1PR1. De plus, les effets de CYM-5442 (EC50=1,4 nM) lorsque comparés

avec les effets du dexaméthasone (EC50=1,8 nM) (fig. 10F) suggèrent que l’agoniste

spécifique de S1PR1 pourrait avoir des effets similaires aux corticostéroïdes en ce qui concerne la libération de chimiokines par les CE bronchiques dans l’asthme, ce qui pourrait constituer une alternative pour les patients résistants aux corticostéroïdes. La réduction de CCL2 induite par le TNF par la drogue CYM-5442 a également été observée dans des lignées de CE pulmonaires humaines (fig. 12A, B), ce qui suggère que le récepteur est également fonctionnel dans les cellules épithéliales chez l’humain. La réduction de la libération de CCL2 induite par une cytokine proinflammatoire suggère donc que l’activation de S1PR1 pourrait être impliquée dans le renversement de la surproduction de chimiokines par l’épithélium bronchique, plus particulièrement pendant des épisodes inflammatoires.

Nous avons également observé que la confluence influençait les résultats obtenus. Nous avons observé que l’activation de S1PR1 semble avoir des effets très importants sur la libération de CCL2 induite par le TNF dans les CE bronchiques de rats asthmatiques en croissance. La réduction de CCL2 dans ces cellules est de 2 à 4 fois plus grande à 50 % de confluence (fig. 13) qu’à 90-100 % (fig 11). L’augmentation de la libération de CCL2 n’est pas seulement impliquée dans le recrutement de leucocytes dans la réponse inflammatoire, mais est également associée à une amélioration du processus de réparation des dommages épithéliaux [117]. Dans ce contexte, la réduction de CCL2 par l’activation des S1PRs, plus

particulièrement de S1PR1, pourrait ainsi interférer avec la réparation de l’épithélium. Cependant, étant donné que l’activation de S1PR1 par CYM-5442 favorise l’étanchéité des CE dans notre modèle, nous spéculons que S1PR1 pourrait être impliqué dans le processus de réparation épithéliale de manière à diminuer le mouvement cellulaire et à favoriser l’établissement de jonctions serrées et par le fait même l’épithélialisation, et donc contribuer à la transition entre la phase motile et la phase de différenciation des cellules épithéliales.

Des expériences complémentaires permettraient de mieux définir les implications de l’activation spécifique de S1PR1 dans le contexte de l’asthme. Puisque l’activation de S1PR1 régule le recrutement des lymphocytes T [124], la modulation de la libération de chimiokines spécifiques à la réponse Th2 pourrait être mesurée après un traitement avec CYM-5442. Des traitements avec CYM-5442 in vivo dans un modèle d’asthme chez le rat permettraient de confirmer les résultats déjà obtenus par l’administration locale d’agonistes de S1PR1 dans un modèle d’asthme chez la souris [89] et de confirmer le lien avec ce projet de recherche dont les résultats ont été obtenus ex vivo. La surexpression de S1PR1 induite par la transfection de CE bronchiques d’un modèle d’asthme chez le rats ou de sujets asthmatiques permettrait également de préciser le rôle de S1PR1 dans les altérations épithéliales dans l’asthme.

Conclusion

Les expériences effectuées dans le cadre de ce projet de recherche suggèrent que la modulation pharmacologique de S1PR1 sur les CE d’un modèle d’asthme pourrait avoir un rôle fonctionnel dans le renversement des altérations épithéliales en favorisant l’étanchéité de l’épithélium et en réduisant la libération d’une chimiokine dans un contexte inflammatoire. Des résultats préliminaires obtenus avec des lignées et des cultures primaires de CE bronchiques de sujets asthmatiques supportent un mécanisme similaire chez l’humain. Ainsi, l’activation de S1PR1 par un agoniste spécifique pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique dans le renversement pharmacologique des altérations épithéliales dans l’asthme. Les résultats de ce projet de recherche constituent un premier

59 pas dans l’étude de la modulation de S1PR1 dans le contrôle des altérations épithéliales dans l’asthme. Il sera important de confirmer ces résultats, en utilisant des lignées supplémentaires de CE bronchiques primaires de notre modèle, et dans des lignées primaires de CE humaines.

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