DISCUSSION ET PERSPECTIVES

Par complémentation d’un mutant tolC d’E. coli, nous avons identifié un nouvel opéron d’efflux chez E. aerogenes. Un plasmide portant eefABC restaure la résistance vis-à-vis d’agent toxiques hydrophobes (tels que le DOC) et de nombreux antibiotiques (tels que le chloramphénicol et l’érythromycine) dans des mutants acrAB d’E. coli et d’E. aerogenes.

Nos résultats indiquent que eefABC est cryptique dans deux souches d’E. aerogenes cultivées dans des conditions standard de laboratoire. L’expression de nombreux systèmes d’efflux est inductible. La présence dans le milieu de molécules naturelles de signalisation (telles que le salicylate) ou d’antimicrobiens (tels que les antibiotiques, les sels biliaires, les solvants ou les métaux lourds) entraîne la surexpression de ces systèmes (Ma et al., 1995 ; McClain et al., 1996 ; Rouquette-Loughlin et al., 2002 ; Rosenberg et al., 2003). Malgré plusieurs essais, nous n’avons pas identifié les conditions de culture permettant l’expression de eefABC.

L’expression des gènes de résistance est souvent sous le contrôle de répresseurs spécifiques dont les gènes sont adjacents à ceux codant les pompes d’efflux. Or, aucun gène codant un régulateur potentiel n’est présent dans l’environnement immédiat de eefABC. Nous avons remarqué que la région promotrice de eefABC, soit les 287 pb entre les codons initiateurs act et eefA, est riche en AT (62 %). Le régulateur global H-NS se fixe préférentiellement aux séquences d’ADN courbées riches en AT et agit en compactant l’ADN (Dorman, 2004). La région promotrice possède des régions de forte courbure d’après l’analyse in silico du programme BEND-IT (http://hydra.icgeb.trieste.it/~kristian/dna/ bend_it.htlm). Nous avons testé l’influence de H-NS sur l’expression de eefABC. Premièrement, nous avons montré la dé-répression d’une fusion Peef ::lacZ dans un mutant hns d’E. coli. Deuxièmement, nous avons détecté la protéine EefA dans une souche d’E. aerogenes exprimant une forme dominante négative de la protéine H-NS d’E. coli. Néanmoins, il nous faudra déterminer si la répression exercée par H-NS est directe ou indirecte. Chez E. coli, H-NS est une des protéines de liaison à l’ADN les plus abondantes (Dorman, 2004). Les homologues de H-NS sont très répandus parmi les entérobactéries et régulent l’expression de nombreux gènes, en inhibant la transcription dans la plupart des cas (Deighan et al., 2000 ; Hommais et al., 2001). Les gènes cibles de la régulation par H-NS sont impliqués dans l’adaptation des bactéries au stress et dans la virulence (Atlung & Ingmer, 1997 ; Beloin & Dorman, 2003). Le rôle de H-NS dans la multirésistance aux antibiotiques a été mis en évidence récemment. La protéine H-NS d’E. coli contrôle la multirésistance en réprimant l’expression de gènes d’efflux (Nishino & Yamaguchi, 2004). En conséquence, la

délétion du gène hns dans un mutant acrAB augmente son niveau de résistance. Dans notre travail, la dé-repression chromosomique de eefABC par H-NSL26P dans E. aerogenes ∆acrA augmente la résistance au chloramphénicol et à l’érythromycine. Malheureusement, le fait que H-NS régule l’expression de eefABC nous aide peu pour identifier les conditions physiologiques d’induction car les conditions abolissant les effets de H-NS sont inconnues. In vitro, les conditions qui réduisent la production de H-NS telles qu’une forte osmolarité, une basse température, un pH acide ou l’anaérobiose, n’ont pas permis d’induire l’expression de eefABC chez E. aerogenes, suggérant que la production de H-NS est toujours suffisante pour maintenir la répression de eef. L’hypothèse actuelle suggère que H-NS réprimerait ses gènes cibles en dehors de l’environnement intestinal, mais permettrait l’expression de gènes spécifiques en réponse à certains stimuli dans l’intestin ou dans un autre environnement in vivo. En effet, l’opéron bgl réprimé par H-NS est transcrit dans le foie de souris lors d’infections septicémiques dues à E. coli (Khan & Isaacson, 1998).

Les conditions d’expression et le rôle physiologique de eefABC chez E. aerogenes sont pour l’instant inconnus. Cependant, comme pour les autres bactéries commensales ou pathogènes, E. aerogenes doit orchestrer des changements drastiques de son profil d’expression pour s’adapter aux conditions de vie dans l’hôte.

Nous avons cloné le gène hns chez E. aerogenes BW16627 grâce à des amorces construites à partir des séquences flanquant hns d’E. coli et la région d’ADN correspondante de K. pneumoniae. La séquence des protéines H-NS d’E. aerogenes et d’E. coli partagent 60% d’identité sur un recouvrement de 135 acides aminés, dont le résidu leucine en position 26. Nous pourrons ainsi étudier en détails le rôle de H-NS sur l’expression de eefABC chez E. aerogenes.

Parallèlement à ce travail, nous avons isolé quatre mutants spontanés résistants au chloramphénicol après étalement de la souche de référence sensible BW16627 (ATCC 15038) sur des boîtes Luria-Bertani contenant une concentration en chloramphénicol de 90 µg/ml. Nous avons testé la sensibilité aux antibiotiques de ces quatre mutants. Bien que ces mutants aient été sélectionnés sur chloramphénicol, ils présentent tous un niveau de résistance élevé vis-à-vis de multiples antibiotiques comparé à la souche parentale (Tableau 1). L’addition de PAβN, un inhibiteur spécifique des pompes d’efflux, entraîne une diminution significative des concentrations minimales inhibitrices au chloramphénicol, à l’érythromycine et à la ticarcilline chez les quatre mutants. Ceci indique que la mutation à l’origine du phénotype multirésistant dans ces quatre mutants est associée à la surexpression d’une pompe d’efflux.

La multirésistance aux antibiotiques résulte parfois de la dé-répression d’un système d’efflux cryptique suite à un événement génétique induit par une pression sélective. Nous avons examiné l’expression de la pompe eefABC dans la souche parentale et dans les quatre mutants dérivés résistants au chloramphénicol en utilisant le plasmide rapporteur Peef ::lacZ décrit précédemment. Le niveau d’expression de la fusion Peef ::lacZ était de 180 à 330 fois supérieur dans les quatre mutants comparé à la souche sauvage (figure 1A). Nous avons analysé les profils protéiques totaux de la souche parentale et des quatre mutants dérivés résistants au chloramphénicol par immuno-détection en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines AcrA et AcrB d’E. coli. Une protéine d’environ 37 kDa et une protéine d’environ 100 kDa régissant respectivement avec des anticorps dirigés contre AcrA et AcrB ont été détectées dans les quatre mutants. Ces deux protéines ne sont pas produites dans la souche sauvage parentale et correspondraient respectivement à EefA et EefB (figure 1B). Ensemble, ces résultats indiquent que la mutation sélectionnée par le chloramphénicol a conduit à la dé-répression du promoteur Peef et à la production des protéines d’efflux.

La surexpression de la pompe EefABC dans les quatre mutants résistants au chloramphénicol dérivés de la souche BW16627 suggère l’expression d’un activateur ou l’inhibition d’un répresseur. Nous avons commencé la comparaison des profils protéiques entre la souche BW16627 d’E. aerogenes et ses quatre mutants dérivés par électrophorèse bi- dimensionnelle afin d’identifier des variations d’expression de protéines régulatrices putatives.

Tableau 1 EAEP289 BW16627 CMR-1 CMR-2 CMR-3 CMR-4 (MDR) (sauvage) Chloramphénicol 512 32 128 128 128 128 Tétracycline 8 2 4 4 4 4 Norfloxacine 128 1 1 1 1 1 Ciprofloxacine 32 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Erythromycine 256 64 512 512 512 512 Télithromycine 64 8 16 16 16 16 Ticarcilline ND 2 16 16 16 16 Amikacine 2 (0.08)* 1 (0.04) 1 (0.04) ND ND ND DOC >80,000 80 80 ND ND ND SDS >40,000 40 40 ND ND ND Acriflavine 128 64 128 128 128 128

CMIs (µg/ml) des souches

(surproducteurs EefABC)

b a

* : Les concentrations minimales inhibitrices (CMIs) ont été déterminées par dilutions en cascade dans du milieu Mueller-Hinton pour chaque antibiotique et dans du milieu Nutrient, pauvre en sels, pour la classe des aminoglycosides.

a _{MDR : multidrug resistant} b _{ND : non déterminé}

Tableau 2

PAβN (26.3 µg/ml) - + - + - +

souches d'E. aerogenes

BW16627 32 2 64 1 2 1 CMR-1 128 2 512 2 16 4 CMR-2 128 2 512 2 16 4 CMR-3 128 2 512 2 16 4 CMR-4 128 2 512 2 16 4 CMIs (µg/ml) pour

BW16627 CMR-1 CMR-2 CMR-3 CMR-4 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

activité

β-galactosidas

e (M

iller Units)

Figure 1. Expression de eefABC dans E. aerogenes BW16627 sauvage et ses quatre mutants dérivés résistants au chloramphénicol (CMR-1 à 4). (A) Expression de la fusion Peef ::lacZ. L’activité β-galactosidase a été mesurée sur des cellules cultivées sur la nuit. Les résultats sont l’expression d’au moins trois expériences indépendantes et les barres d’erreur sont indiquées. (B) Immuno-détection de EefA et EefB. Les extraits protéiques totaux ont été séparés par SDS-PAGE, transférés sur nitrocellulose et révélés avec des anticorps dirigés contre les protéines AcrA (panneau supérieur) ou AcrB (panneau inférieur) d’E. coli (don de V. Koronakis).

ARTICLE 2 :

Chloramphenicol and expression of multidrug efflux pump in Enterobacter aerogenes. Didier Ghisalberti*, Muriel Masi*, Jean-Marie Pagès and Jacqueline Chevalier. Biochem. Biophys. Res. Comm. 328:1113-1118 (2005).

E. aerogenes est une bactérie capable de s’adapter rapidement à l’antibiothérapie au cours du traitement d’infections nosocomiales. Il est donc important d’analyser les effets de molécules antibiotiques sur une souche sensible d’E. aerogenes.

Le chloramphénicol est un antibiotique bactériostatique qui inhibe la synthèse des protéines. C’est aussi un sélecteur puissant de mutants Mar (Multiple Antibiotic Resistance) d’E. coli (Cohen et al., 1989 ; Mc Murry et al., 1994).

Dans ce travail, nous avons étudié l’évolution du profil de résistance de variants d’E. aerogenes entraînés sur des concentrations croissantes de chloramphénicol in vitro, afin de rechercher des éléments de réponse quant à l’émergence de la multirésistance en clinique. Nous avons entraîné la souche E. aerogenes ATCC 13048 sur chloramphénicol selon la méthode des gradients de Szybalski (8-16 ; 16-64 et 64-128 µg/ml). Nous avons étudié le variant CM-64, capable de pousser en présence de 64 µg/ml de chloramphénicol, la variation de la sensibilité à plusieurs antibiotiques et les modifications du profil protéique membranaire en ciblant à la fois les protéines intervenant dans les mécanismes de perméabilité et d’efflux. Les relations entre l’apparition de la multirésistance et l’expression de régulateurs connus ont été recherchées.

Chloramphenicol and expression of multidrug efflux pump