L'objectif de ce travail était de mettre en place un modèle dynamique de biofilm buccal pluri- espèces en faisant évoluer un modèle statique précédemment mis en place et validé au sein du laboratoire. Il s’agissait d'obtenir un protocole fiable et reproductible quant à sa mise en culture, son recueil et son étude.
Cet objectif a partiellement été atteint, les résultats les plus décevants ayant été ceux de l’analyse du biofilm. En effet, la méthode d’identification faisant appel à la mise en culture sur géloses n’a pas été reproductible et surtout, nous n'avons pas réussi à ré-isoler et identifier F.
nucleatum avec cette méthode.
Le protocole 1 n’a pas donné de résultats concluants.
Ensuite, en raison de la présence de contaminations répétées sur nos milieux de culture, nous avons voulu simplifier les étapes du protocole en diminuant le nombre de manipulations, afin de minimiser ces risques de contaminations. Ainsi, pour le deuxième protocole, les étalements sont effectués uniquement sur géloses Columbia au sang, qui sont des géloses achetées et prêtes à l’emploi, contrairement aux cinq autres géloses qui sont élaborées au sein du laboratoire. Cela permet aussi un gain de temps.
En raison de difficultés d’identification lors des observations au MO et des résultats obtenus suite à ces observations, nous avons modifié la composition de l’inoculum. En effet, nous avons constaté que S. mutans se développait trop et que nous retrouvions difficilement les autres espèces. Nous avons donc voulu vérifier que cette prédominance de S. mutans empêchait les autres espèces de croître. De plus, nous avions des difficultés à différencier S. mutans de S.
oralis par la simple observation au MO. Suite à ces constats, et sachant que S. mutans a une
forte attirance pour le saccharose, ce qui favorise son développement, nous avons mis en place deux types de biofilms. Un premier qui intégrait uniquement S. mutans, A. viscosus, P.
gingivalis et F. nucleatum, et avec un FUM enrichi uniquement en glucose. Un second composé
de S. oralis, A. viscosus, P. gingivalis et F. nucleatum, (sans S. mutans), et qui contenait le milieu FUMe habituel.
Malheureusement, les résultats des biofilms avec S. oralis (sans S. mutans) n’ont pas pu être pris en compte car un problème technique est survenu au cours de leur mise en place.
Pour les biofilms composés de S. mutans, A. viscosus, P. gingivalis et F. nucleatum avec FUM enrichi en glucose, seul F. nucleatum n’a pas été retrouvé.
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Toutefois cette espèce a pu être mise en évidence, par observation au MO, dans le milieu environnant, ce qui nous fait soupçonner un problème au niveau de sa mise en culture sur géloses et non au niveau de son intégration dans le biofilm.
Nous avons donc par la suite testé de nouveaux milieux de culture devant favoriser la croissance de F. nucleatum (géloses TGY vert brillant). Celles-ci n’ont cependant pas permis d’isoler F.
nucleatum. De plus, les bactéries à Gram positif s’y sont développées. Ce milieu de culture ne
s’étant pas montré plus sélectif, nous l’avons abandonné.
Pour le protocole 3, nous sommes revenus à un inoculum à cinq espèces mais en remplaçant S.
mutans par S. salivarius car S. mutans, fortement acidogène, est connu pour faire chuter le pH
du milieu environnant, ce qui aurait pu être à l’origine du fait que les autres bactéries, et en particulier F. nucleatum, avaient du mal à se développer.
Les résultats des mesures du pH ont montré qu’il était légèrement supérieur pour les biofilms contenant S. salivarius, comparés aux biofilms contenant S. mutans. Cependant, les observations au MO des bactéries recueillies dans le milieu environnant ont continué à être positifs quant à la présence de F. nucleatum et des autres espèces.
De même, que ce soit sur les biofilms avec S. mutans, A. viscosus, P. gingivalis et F. nucleatum ou avec S. salivarius, S. oralis, A. viscosus, P. gingivalis et F. nucleatum, nous n'avons retrouvé
F. nucleatum sur aucun des biofilms lors des observations au MO, alors qu’il a été identifié sur
tous les biofilms par la méthode de qPCR.
La corrélation des résultats précédents nous a ainsi confortés dans l’idée que l’écueil d’identification se situait au niveau de la mise en culture du biofilm sur géloses et non au niveau de sa formation.
Nous avons donc réalisé des co-cultures entre F. nucleatum et chacune des quatre autres espèces bactériennes de base et les avons étalées sur des géloses Columbia au sang. S. oralis, S. mutans,
A. viscosus et P. gingivalis ont tous été identifiés sur les géloses respectives tandis que F. nucleatum a été retrouvé uniquement sur la gélose sur laquelle la co-culture F. nucleatum/P. gingivalis avait été étalée.
Il existe donc probablement des compétitions entre F. nucleatum et les autres espèces car lorsqu’il est étalé en culture pure sur gélose Columbia au sang, F. nucleatum se développe bien. Pour les derniers biofilms avec A. actinomycetemcomitans et/ou T. forsythia, nous les avons également étalés sur des géloses FAA + Vancomycine + 5% de sang de mouton et sur des géloses Schaedler + 5% de sang de mouton, en plus des étalements habituels sur géloses Columbia au sang, pour essayer d’isoler F. nucleatum.
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Les géloses Schaedler et FAA sont utilisées pour la culture de bactéries anaérobies. L’ajout de sang favorise le développement des bactéries exigeantes. La vancomycine inhibe les bactéries à Gram positif et P. gingivalis est également sensible à cet antibiotique.
Cependant, aucune des colonies recueillies n’a correspondu à F. nucleatum et, a contrario, nous avons identifié des bactéries à Gram positif et des petits bacilles à Gram négatif sur les géloses FAA.
Les résultats de l’identification par la qPCR sur l’ensemble des colonies recueillies sur les géloses sur lesquelles avaient été étalés les biofilms ont révélé la présence de F. nucleatum. Le problème ne serait donc pas un problème de mise en culture mais de détection.
La méthode associant mise en culture, coloration de Gram et observation au MO est une méthode de base pour l'identification bactérienne mais elle présente certaines limites, dont nous avons fait l'expérience pour certaines :
- difficulté à discriminer certaines espèces comme S. oralis et S. mutans ou P. gingivalis,
A. actinomycetemcomitans et T. forsythia,
- nécessité d'avoir et de conserver des bactéries vivantes, méthode non adaptée pour les espèces non cultivables ou dont la culture est difficile…
Le protocole est également chronophage, et l'observation au MO demande une certaine expertise pour différencier différentes espèces. De plus, l’examen microscopique ne permet qu’une identification de présomption et non une identification de certitude.
Cependant, cette méthode d’identification est relativement simple à mettre en œuvre, ne nécessite pas de matériel sophistiqué et est donc moins coûteuse comparée à d’autres méthodes comme la spectrométrie de masse MALDI-TOF et les techniques de biologie moléculaire. Elle peut donc être utile pour vérifier la pureté d’une culture ou orienter l’identification afin de sélectionner des colonies qui seront ensuite identifiées par une ou des méthodes nécessitant plus d'expertise, plus complexes à mettre en œuvre et plus onéreuses (comme cela a été le cas par exemple dans notre premier protocole pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF et la PCR). L’utilisation du MALDI-TOF n’a pas été concluante pour le protocole 1. Cette technique a mieux fonctionné pour le protocole 2, après extraction des protéines, mais elle ne semblait pas être complètement au point car même sur des échantillons témoins, les identifications ont été négatives (résultats non montrés).
Cette méthode présente aussi certains inconvénients tels que la nécessité de réisoler les bactéries afin d’obtenir une culture pure de l’espèce à identifier, et une étape supplémentaire d’extraction
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des protéines. Elle demande également du matériel sophistiqué et un personnel formé à cette méthode.
Le protocole s’est ainsi révélé être assez contraignant car nous dépendions d’un autre laboratoire. Néanmoins, elle nous a permis de détecter et/ou de confirmer la présence de contaminations.
La méthode de PCR est une méthode fiable et précise et nous a montré les limites de l'identification par l’analyse microscopique. En effet, sur certaines colonies pour lesquelles nous pensions identifier une espèce du biofilm, les résultats de la PCR ont été négatifs.
Elle présente l’avantage de pouvoir détecter des bactéries difficilement cultivables. Le revers à cela est néanmoins de ne pas différencier les cellules vivantes de celles qui sont mortes. La qPCR est la seule méthode qui a donné des résultats positifs pour toutes les espèces et ceci a été reproductible pour tous les biofilms pour lesquels nous l’avons utilisée.
Elle semble être la technique la plus intéressante car elle permet de s’affranchir de la mise en culture et ne nécessite pas d'avoir une culture pure ; l'intégralité du biofilm peut être analysé automatiquement, ce qui permet un gain de temps considérable. De plus, elle rend possible la quantification des bactéries et ne requiert pas la réalisation d’un gel d’agarose pour la lecture des résultats, ce qui représente des avantages supplémentaires par rapport à la PCR. La qPCR présente également, comme la PCR, l’avantage de pouvoir détecter des bactéries difficilement cultivables.
Elle nécessite toutefois du matériel spécialisé coûteux, une mise en place longue et une mise en œuvre par une personne compétente. L’analyse des résultats demande également une certaine expertise.
On peut ainsi se poser la question de l’utilité de la méthode associant mise en culture, coloration de Gram et examen microscopique. On pourrait envisager de se passer de cette dernière et ne faire l'identification qu'avec la qPCR ; cela simplifiera ainsi le protocole, qui sera aussi moins chronophage, mais qui nécessite un équipement onéreux, ce qui n’était pas le but premier de ce travail.
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Conclusion
Plusieurs modèles de biofilm buccal ont déjà été développés. Cependant, ceux-ci peuvent être assez encombrants, complexes à mettre en œuvre et onéreux. Nous avons voulu mettre en place, dans ce travail, un modèle dynamique de biofilm pluri-espèces. Nous n’avons cependant pas réussi à obtenir un protocole fiable et reproductible, en particulier au niveau de l’analyse du biofilm. En effet, nous ne sommes pas parvenus à ré-isoler et identifier F. nucleatum avec la méthode d’identification faisant appel à la mise en culture sur géloses. Des recherches doivent donc être poursuivies pour trouver un moyen de détecter cette espèce sur les géloses. Ce modèle de biofilm pourrait alors compléter les modèles existants, tout en permettant une élaboration simple, peu onéreuse, et en essayant toujours de se rapprocher des conditions réelles.
L’application de la méthode d’étude par qPCR sur le biofilm dynamique pluri-espèces mis en place dans ce présent travail fait plus particulièrement l'objet d'une autre thèse en cours.
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