La présence de souches virulentes de S. aureus dans plusieurs types d’environnements constitue un danger à la santé publique. Durant ce projet de doctorat, l’option d’utiliser des phages a été développée pour éliminer S. aureus. Pour ce faire, plusieurs points ont été détaillés afin d’élaborer et d’évaluer l’efficacité de deux cocktails de phages différents durant une mini-production en laboratoire de fromage de type Cheddar.
Problématique de S. aureus
Les problèmes de santé associés à S. aureus dépendent de plusieurs souches très différentes. Tout d’abord, une étude de génotypage de S. aureus a été adoptée au cours de cette étude. Cinquante-sept souches de S. aureus ont été obtenues de plusieurs environnements et ont été regroupées à l’aide de la méthode de MLST ainsi que de l’algorithme eBURST. Ces deux méthodes permettent la classification des souches par numéros de STs et de CCs respectivement. Un ST est défini par la combinaison de 7 gènes domestiques hautement conservés et aussi nommés allèles. Deux STs appartiennent au même CC si elles partagent au moins 6 allèles en commun. Ces stratégies de classification ont permis de regrouper les 57 souches en 18 groupes de STs rassemblés sous 14 CCs (voir annexe).
Une comparaison des CCs avec les sources d’isolement de chaque souche de S. aureus a permis de définir une relation entre le génotypage et les sources d’isolement. En effet, la répartition des CCs est dépendante du milieu d’isolement des souches. Les souches isolées du milieu laitier canadien se sont principalement regroupées en trois CCs soit CC97, CC151 et CC126. Ces trois CCs sont dominants dans plusieurs pays et sont communément associés à la mammite bovine et caprine au Brésil, aux États-Unis, en Irlande, en Espagne et en Italie (Rabello et al., 2007; Smith et al., 2005; Smyth et al., 2009). Du côté des souches de S. aureus isolées du milieu clinique et de la collection Félix d’Hérelle, les CCs tendent à être plus diversifiés.
Un autre point à mentionner est l’absence de relation entre le numéro de CC et la lysotypie des souches. En effet, les souches appartenant à un même CC peuvent avoir des
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sensibilités phagiques différentes. De même, des souches peuvent avoir une sensibilité semblable aux onze phages testés indépendamment du CC auquel elles appartiennent.
Ensuite, les génomes des 57 souches ont été testés pour la présence d’un ou de plusieurs des gènes d’entérotoxines principales, sea à see. À la suite du criblage, le génome d’une seule souche de S. aureus, soit SMQ1320, contenait le gène d’entérotoxine C. L’ES C est une cause importante d’intoxication alimentaire et est souvent produite par des souches de
S. aureus isolées du lait de vache et de chèvre (Ercolini et al., 2004; McLauchlin et al.,
2000). SMQ1320 est donc la seule souche isolée du milieu laitier canadien et productrice d’entérotoxines dans notre groupe de souches de S. aureus. De plus, elle fait partie d’une minorité de souches capable d’être lysée par les onze phages staphylococciques recueillis de la collection Félix d’Hérelle. Finalement, elle appartient au complexe clonal retrouvé partout dans le monde et exclusivement confirmé dans les isolats bovins, soit CC151 (Hata
et al., 2010). Considérant tous ces points, la souche S. aureus SMQ1320 a été sélectionnée
pour l’application alimentaire.
Une des forces de cette étude est le fait d’utiliser des souches différentes de S. aureus en termes de sources d’isolement, de génotypage et de lysotypie. La disponibilité de complexes clonaux internationaux comme CC97 et CC151 (Hata et al., 2010; Smith et al., 2005) ainsi que de souches provenant de différents territoires canadiens constituent des outils et des cibles parfaits pour l’élaboration de cocktails de phages polyvalents et pour la consolidation de leur efficacité anti-staphylococcique. Vu que la majorité des souches ciblées par les cocktails de phages élaborés dans cette étude sont de provenance canadienne, il serait intéressant de voir si ces cocktails seraient efficaces contre des souches isolées de d’autres régions géographiques afin de confirmer leur utilisation généralisée.
Stratégie de sélection et d’élaboration de bons agents de biocontrôle
staphylococciques
Le but principal de cette étude était de sélectionner des outils de biocontrôle efficaces contre S. aureus dans les produits laitiers et plus précisément dans la production de fromage. Pour ce faire, une stratégie de sélection de phages a été définie en se basant sur des critères précis. Onze phages de staphylocoques ont été collectés de différents
115 environnements et ont été caractérisés afin d’élaborer des cocktails anti-S. aureus composés de phages différents répondant à divers critères de sélection. L’utilisation d’un cocktail de phages a déjà été prouvée comme étant plus efficace que l’action d’un phage seul et permet la réduction, ou l’élimination dans certains cas, de la croissance de souches résistantes aux phages (Carlton et al., 2005; Drilling et al., 2014).
Le premier point de caractérisation se repose sur la confirmation du caractère virulent strict du phage. Un phage strictement virulent ne possède pas les gènes responsables de son intégration dans le chromosome de l’hôte. Dans certains cas, ces gènes sont mutés et leurs fonctions sont réprimées les rendant incapables de s’intégrer (Garcia et al., 2009a). De plus, il est important que le génome d’un agent de biocontrôle phagique ne contienne pas de gène de virulence pouvant affecter son caractère sécuritaire. Les génomes des 11 phages ont été séquencés et aucun gène de virulence ou lysogénique connu n’a été retrouvé dans les génomes phagiques sauf pour le phage LH1. Ce dernier a été isolé à partir d’un échantillon de lait cru québécois. Notons qu’un protocole simple a été développé au cours de ce projet pour isoler des phages du lait cru dont le phage LH1 et le phage phi2. Après l’analyse complète de son génome, un module de lysogénie a été retrouvé, soit la présence de gènes codant possiblement pour une intégrase et un répresseur, en plus de gènes codant pour les deux sous-unités de la toxine PVL, LukS-PV et LukF-PV. Le phage LH1 est probablement un prophage ou un variant devenu virulent suite à une mutation. La présence de gènes codant pour une toxine ainsi que d’un module lysogénique dans le génome du phage LH1 fait de lui un phage non utilisable dans toute application. D’un autre côté, un mutant naturel de ce phage, appelé LH1-MUT, a été isolé par hasard suite à la caractérisation du phage LH1. Une comparaison entre LH1 et LH1-MUT a permis de remarquer la délétion complète du gène d’intégrase ainsi que des gènes encodant les deux sous-unités de la toxine PVL. Il semble qu’un choc thermique a mené à une délétion possiblement suite à une recombinaison intramoléculaire entre des répétitions directes d'ADN homologue. Ces constatations ont permis de rejeter le phage LH1 et de considérer son mutant naturel pour la suite des expériences. Dix phages ont donc été considérés dans la suite du projet.
Cinq phages appartenant à la famille des Myoviridae ont été amplifiés sur un simulant de S. aureus, une souche staphylococcique non pathogène de S. xylosus. Les phages
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Pyophage, Team1, Team2, phi812 et K sont les seuls phages pouvant lyser cette espèce. Une approche similaire a déjà été utilisée pour amplifier le produit phagique anti-L.
monocytogenes ainsi que le phage mycobactérien D29 amplifié sur la bactérie du sol Mycobacterium smegmatis (Gill & Hyman, 2010). Pour vérifier la reproductibilité de cette
approche ainsi que l’identité des phages amplifiés sur l’une ou l’autre des espèces staphylococciques, une étude approfondie du phage Team1 amplifié sur S. aureus et S.
xylosus a été produit autant au niveau microbiologique qu’au niveau génomique. La
confirmation de l’identité des deux dérivés du phage Team1 permet de considérer cette démarche afin de sécuriser la santé du personnel manipulateur ainsi que l’innocuité du produit phagique et de l’aliment.
Ensuite, l’élaboration des cocktails anti-S. aureus s’est basée sur la sélection de phages à large spectre lytique. Pour ce faire, les 57 souches de S. aureus identifiés ont été utilisées pour définir le caractère polyvalent des phages. Les phages appartenant à la famille des
Myoviridae et des Podoviridae ont les plus larges spectres lytiques autant contre des
souches de S. aureus isolées du milieu laitier que contre des souches cliniques et résistantes aux antibiotiques. Pour ce qui est des myophages, les spectres lytiques des phages Pyophage, Team1 et Team2 sont identiques. Afin d’éliminer toute redondance dans les cocktails de phages, les phages Pyophage et Team2 ont été écartés puisque le phage Team1 a été caractérisé en profondeur. Le total des agents de biocontrôle phagiques potentiels a été réduit à 8 phages. D’un autre côté, les phages Team1, phi812 et K ont des spectres lytiques différents tout comme les deux podophages P68 et 44AHJD. Parmi les myophages, le phage K a le plus étroit spectre lytique allant jusqu’à lyser 50 des 57 souches de S. aureus testées. De plus, lorsque ce phage a été amplifié sur S. xylosus ou sur S. aureus, son efficacité s’est restreinte suite à la chute de sa concentration de 4 à 5 unités de log10 par
rapport à celle obtenue sur sa souche hôte. Ce phénomène observé pour le phage K a aussi été montré dans une autre étude (O'Flaherty et al., 2005b). Pour ces raisons, le phage K n’a pas été considéré dans l’élaboration des cocktails de phages.
La présence de souches de S. aureus résistantes aux myophages et sensibles aux podophages et vice versa ont permis de consolider l’idée d’utilisation de cocktails composés de phages appartenant à des familles différentes de Caudovirales. Cette approche
117 minimise l’apparition de souches résistantes aux phages et la possibilité d’une recontamination du produit alimentaire.
Considérant l’utilisation industrielle des phages, deux aspects nécessitent l’acquisition de connaissances : 1) quelles sont les méthodes de production, de conservation et d’inoculation des phages et 2) quelle est leur activité en matrice fromagère.
Un point important à évaluer est donc l’efficacité de l’agent de biocontrôle dans le milieu de culture in vitro ainsi que dans la matrice alimentaire in vivo. Dans cette étude, les phages ont été testés pour leur efficacité dans le lait et les produits laitiers dont le fromage de type Cheddar. Lors de la production de ce dernier, des étapes de pasteurisation et d’affinage ont été réalisés. Ces étapes se différencient par des conditions de températures élevées et de bas pH couplés au milieu semi-solide du caillé.
En ce qui a trait à la méthode d’inoculation, il fallait déterminer si les phages pouvaient être ajoutés au lait cru. Les phages ont donc été tout d’abord testés pour leur résistance à la pasteurisation. Deux phages ont résisté le plus à cette condition, soit les phages LH1-MUT et phi2, tous deux isolés du lait cru. Il est tentant d’assumer que la résistance des phages à cette température dépend de leur source d’isolement. Isolés du milieu laitier, il est suggéré que les phages LH1-MUT et phi2 sont plus adaptés à cet environnement, ses changements et sa population staphylococcique (Brüssow, 2005; Koskella & Meaden, 2013). Des conclusions similaires ont été tirées suite à l’étude de la résistance au traitement de 15 secondes à 72 ºC de deux phages staphylococciques de Siphoviridae isolés du milieu laitier (Garcia et al., 2009b). D’un autre côté, le phage MSA appartenant à la famille des
Siphoviridae semble avoir un spectre lytique large par rapport aux autres membres de cette
famille. Ceci pourrait être dû au fait qu’il s’agit d’un mutant naturel d’un phage tempéré isolé après sa persistance de plus de 20 jours dans la circulation sanguine (Capparelli et al., 2007). Suite à cette approche, le phage MSA est capable de lyser plusieurs souches cliniques de S. aureus dont celles résistantes aux antibiotiques. Ce phage pourrait être considéré pour son utilisation dans un cocktail à retombée médicale. Bien qu’appartenant à la famille des
Siphoviridae et possédant des spectres lytiques restreints par rapport aux membres des
autres familles, les phages LH1-MUT et phi2 ont été considérés pour leur ajout dans les cocktails de phages.
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Par ailleurs, une résistance de tous les phages testés dans un caillé modèle reconstitué de type Cheddar après 28 jours d’affinage a permis de conclure sur l’étape optimale à laquelle le cocktail de phages doit être ajouté durant la production de ce type de fromage. L’addition de ce dernier s’est réalisée après la pasteurisation du lait et avant l’étape de formation du caillé afin de protéger tous les phages de la chaleur, d’augmenter les probabilités d’interactions phages-hôte bactérien et d’atteindre une efficacité anti- staphylococcique maximale.
Un dernier critère à considérer pour la sélection de bons agents de biocontrôle phagiques est le maintien de l’efficacité du phage du moment de sa production, par des fournisseurs spécialisés, jusqu’à son utilisation en fromagerie. Idéalement, la concentration des phages devrait demeurer stable durant une longue période de temps indépendamment des changements de l’environnement. Afin d’atteindre ce but, la méthode d’encapsulation en billes d’alginate a donné lieu non seulement à une protection phagique contre la congélation mais aussi à la concentration de phages. La concentration des phages encapsulés est due à l’expulsion de liquide, lors de la période de raffermissement du gel en CaCl2, générant un nombre plus élevé de phages emprisonnés dans la bille. L’encapsulation
des phages dans des microparticules de 0,5 mm de diamètre composés de gel d’alginate couplé au calcium et leur trempage dans une solution contenant 10 % de glycérol et 10 % de maltodextrine s’est avérée la meilleure méthode de conservation phagique à 4°C.
À la suite de l’étude de ces critères, six des onze phages répondant à tous ces paramètres ont été sélectionnés pour l’élaboration de cocktails, dont deux phages différents de chaque famille de Caudovirales : i) Myoviridae, phages Team1 et phi812, ii)
Podoviridae, phages P68 et 44AHJD et iii) Siphoviridae, phages LH1-MUT et phi2.
Afin de minimiser la probabilité d’apparition de souches résistantes aux phages, les cocktails ont été élaborés de façon à être composés de trois phages, dont un phage de chaque famille. Huit combinaisons différentes ont été envisagées. Dans des travaux précédents non présentés dans cette thèse, le cocktail Pyophage/P68/LH1-MUT a fait preuve d’efficacité dans du lait pasteurisé contre la souche S. aureus SMQ1282 isolée du milieu laitier sans permettre la croissance de souches résistantes aux phages. Le phage Pyophage étant identique au phage Team1, ceci a poussé à la sélection de deux
119 combinaisons de cocktails de phages, soit les cocktails Team1/P68/LH1-MUT et phi812/44AHJD/phi2.
Évaluation de l’efficacité et de la sécurité de deux cocktails de phages
staphylococciques
Des mini-productions de fromage de type Cheddar ont été réalisées en laboratoire en mimant toutes les conditions de température et de pH industrielles. L’ajout de cocktail de phages s’est fait après l’étape de pasteurisation dans du lait contaminé par 106 UFC/ml de
S. aureus SMQ1320 (Ben Abdallah et al., in preparation; Bueno et al., 2012) et
supplémenté par 107 UFC/ml de ferment lactique. Une réduction de plus de 3 unités de log10 de la concentration staphylococcique a été notée dans le caillé non-affiné et sous la
limite de détection de 1000 (??) UFC/ml après un affinage de 14 jours à 4 ºC. Et ce, avec l’un ou l’autre des cocktails et à une MOI de 15 et plus. L’efficacité de ces cocktails de phages a donc été confirmée. Des concentrations phagiques plus basses pourraient être testées ultérieurement afin d’identifier la MOI optimale pour la réduction maximale de la concentration staphylococcique.
La dernière étape a été de s’assurer de la sécurité d’utilisation des cocktails dans un milieu laitier. Tout d’abord, des purifications de phages ont été utilisées lors de ces expériences éliminant les impuretés ou les débris bactériens pouvant altérer l’innocuité du produit phagique. Ensuite, utilisant une souche staphylococcique productrice d’entérotoxines C, nous avons vérifié l’absence de surproduction de cette toxine et de sa sécrétion dans le milieu suite à l’ajout de phages. La présence de ces derniers pourrait déclencher ce phénomène en causant une situation de stress. Une autre supposition serait que la lyse bactérienne par les phages conduirait au relargage de tout le contenu du cytoplasme bactérien dans le milieu accompagné des entérotoxines actives. Ce dernier point non mentionné dans aucune des études antérieures pourrait constituer un danger à l’utilisation généralisée des phages dans toute application. Une technique immuno- enzymatique de détection a été utilisée afin de vérifier la présence ou l’absence de la toxine ES C dans du lait pasteurisé, du lait cru et une production complète de fromage de type Cheddar. Une approche de vérification de la surproduction de toxine au lieu de la
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surexpression du gène sec a été abordée vu la simplicité et la disponibilité de la méthode de détection des toxines. De plus, la présence du gène de toxine dans le génome bactérien n’implique pas nécessairement la production et la sécrétion définitives de la toxine (Loncarevic et al., 2005). Suite aux différents tests appliqués, il a été observé que la présence de phages ne mène pas à la surproduction de la toxine ES C. Toutefois, dans certains cas, leur présence a même permis de réduire la production d’ES C. Ceci pourrait être le résultat de la lyse de certaines cellules productrices d’ES C dans le milieu. Par conséquent, la sécrétion de toxines s’est arrêtée suite à la chute de la concentration staphylococcique au-dessous du seuil minimum permettant la production de toxines (<105 UFC/ml ou <103 UFC/ml pour certaines souches de S. aureus hautement virulentes). Cette manipulation a permis de confirmer l’utilisation sécuritaire des phages dans toute application pour ce qui est de la toxine ES C. Toutefois, ceci ne donne pas une confirmation générale. Il serait donc important de vérifier ultérieurement la reproductibilité de ces résultats pour ce qui est des autres entérotoxines staphylococciques principales (ES A, B, D et E) ainsi que toute protéine ou toxine staphylococcique pouvant altérer l’innocuité et la sécurité, autant alimentaire que médicale. Ceci pourrait de même être vérifié pour tout procédé antibactérien plaçant S. aureus dans une situation de stress et déclenchant son mécanisme de défense.
Au final, l’utilisation des phages comme additifs pour le biocontrôle de fromages de type Cheddar a été prouvée comme étant efficace et sécuritaire.
Afin d’augmenter l’efficacité des phages et de diminuer l’émergence de résistance bactérienne aux phages, les cocktails de phages devraient sans doute être constamment mis à jour à l’aide de nouveaux phages répondant à des critères de sélection (Kutateladze & Adamia, 2010; Sulakvelidze, 2013). Ayant élaboré et testé deux cocktails de phages efficaces contre S. aureus, il sera possible aussi de faire une « rotation » des cocktails de phages afin d’inhiber la probabilité d’occurrence de souches résistantes aux phages et d’assurer ainsi l’innocuité du produit final.
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Conclusions et perspectives
S. aureus est un pathogène alimentaire et médical dangereux de par ses facteurs de
virulence multiples nécessaires pour sa propagation et son évolution. Dans le contexte de cette thèse de doctorat, la production et la sécrétion d’entérotoxines staphylococciques ont été ciblées dans une production de fromages de type Cheddar en procédant à la réduction de la population de S. aureus. Pour ce faire, l’alternative anti-S. aureus proposée est l’utilisation de cocktails de phages. Les phages sont des virus capables de lyser spécifiquement une souche ou une espèce bactérienne donnée sans affecter la microflore du milieu tout en étant non nocifs pour l’homme.
À la suite des résultats obtenus, on peut conclure, premièrement, que les phages isolés du lait, LH1-MUT et phi2, ont fait preuve d’une meilleure résistance aux changements de l’environnement laitier, soit au traitement à la chaleur. Deuxièmement, l’utilisation d’un simulant non pathogène de S. xylosus pour l’amplification des phages pourrait éliminer la