P54nrb est une protéine multifonctionnelle nucléaire qui possède deux RRMs dans sa portion N-terminale et un motif HTH suivit d'une séquence d'acides aminés chargés dans sa fraction C-terminale. C'est grâce à la présence de ces domaines que p54nrb est capable de lier l'ARN et l'ADN et qu'elle participe à plusieurs processus nucléaires tels que la maturation des ARNm, le maintien de l'intégrité des paraspeckles, la rétention des ARNs hyper-édités et la réparation de l'ADN. Récemment, il a été démontré que p54nrb est capable de lier plusieurs ARNs différents et que sa phosphorylation régule négativement cette capacité de liaison excepté pour les ARNs riches en G (Bruelle et al., sous presse, voir annexe A). En effet, une étude in vitro nous a démontré que la liaison de p54nrb à la séquence du site d'épissage en 5' est régulée par la phosphorylation alors que sa liaison à l'ARN riche en G NEAT1 ou à des homoribopolymères de G n'est pas affectée par cette modification (Bruelle et al., annexe A, figures 5C, 6C et 7A). Bien que la structure RMN du RRMl (pdb : 2CPJ) et celle par homologie du RRM2 de p54nrb aient été réalisées, la caractérisation de l'interaction de ces motifs à l'ARN n'a jamais été faite. La présente étude a donc portée sur la caractérisation biochimique et structurale de la liaison du DLA de p54nrb à l'ARN du 5'SS et à des ARNs de polyguanosines.
4.1 Analyse des différents domaines du DLA de p54nrb
Le premier volet du projet a consisté à produire des constructions plasmidiques permettant l'expression de divers segments du DLA de p54nrb. Trois segments protéiques de ce domaine ont été exprimés et purifiés (N-RRM1/2, N-RRMl et RRM2, voir figure 11). L'analyse de ces polypeptides par différentes techniques biophysiques a permis de recueillir de l'information pertinente sur la nature du DLA de p54nrb.
4.1.1 Les segments protéiques N-RRM1/2 et RRM2 sont des protéines instables Le segment protéique N-RRMl/2 n'a pu être utilisé pour les expériences par RMN puisqu'il précipitait à faible concentration (~ 0,1 mM) aux conditions utilisées. Comme le N-RRMl/2 est une grosse protéine (27 kDa), les faibles concentrations des échantillons
RMN de cette protéine n'étaient pas suffisantes pour permettre l'obtention de spectres RMN de qualité (figure 12). Pour ce qui est du RRM2, les différentes analyses par RMN et par DLS ont démontré que cette protéine agrégeait rapidement dans des conditions de sel et de température standards (100 mM NaCl, 25 °C). Par contre, ces mêmes techniques ont permis de voir que la baisse de la température et l'augmentation de la force ionique du milieu diminuait considérablement cette vitesse d'agrégation. Comme la protéine N- RRMl/2 regroupe les protéines N-RRMl et RRM2 et que la construction N-RRMl est très soluble, il se pourrait que le RRM2 soit responsable de l'instabilité de cette protéine. Il serait donc intéressant de vérifier l'effet de la baisse de la température et de l'augmentation de la force ionique du milieu sur la stabilité du N-RRMl/2 afin de permettre l'enregistrement de spectres RMN. En effet, la caractérisation de l'interaction de ce fragment avec l'ARN permettrait de vérifier s'il existe de la coopérativité entre les 2 RRMs du DLA de p54nrb sans être obligé de passer par la reconstitution du domaine (N-RRMl + RRM2 + ARN, figure 19C et 23C).
4.1.2 Le N-terminal de p54nrb est non-replié et ne semble pas perturber la structure du RRMl
L'analyse du spectre RMN 'H-^N HSQC de la protéine N-RRMl permet de constater une belle dispersion de pic de 3 ppm démontrant que la protéine semble bien repliée. De plus, les déplacements chimiques des résonances amides du RRMl provenant de la structure RMN du motif (pdb: 2CPJ), fournie par le Dr Takashi Nagata, concordent avec ceux du N-RRMl nous permettant de discerner les pics du RRMl et du N-terminal. Par ailleurs, le fait que les déplacements chimiques provenant du Dr Nagata concordent avec ceux du RRMl de la protéine N-RRMl indique que le N-terminal de p54nrb ne semble pas interagir avec le RRMl sous sa forme non-phosphorylée. De plus, l'analyse du *H-
15N HSQC du N-RRMl montre peu de dispersion des pics non attribués suggérant que la
section N-terminale de p54nrb soit non repliée. D'ailleurs, une analyse du N-terminal seul (résidus 1 à 73 de p54nrb) démontre un spectre de DC typique des protéines non structurées avec un minimum à environ 199 nm et un spectre RMN du proton très peu dispersé dans la région des amides (Annexe D). Finalement, le *H-15N HSQC du N-
être théoriquement observés pour les 71 résidus (dont 7 prolines) non attribués du N- terminal de p54nrb. Le fait que cette section de la protéine soit non repliée et qu'elle contienne 19 glutamines et 8 histidines dont les résonances amides sont susceptibles de se superposer est probablement ce qui fait qu'on ne peut pas observer tous les pics attendus.
4.1.3 Le segment protéique RRM2 est replié et comporte des structures d'hélice-a et de feuillet-B
Une analyse de la séquence primaire de p54nrb a permis de découvrir que cette protéine possède 2 RRMs. La structure du premier RRM de p54nrb a été réalisée par RMN (pdb : 2CPJ) et a révélé un motif de topologie classique (Pioti 020301204)- Une prédiction de la structure du RRM2 par homologie (Modeller) montre que ce motif semble aussi posséder la topologie typique des RRMs (figure 7). Par contre, aucune étude n'a été réalisée jusqu'à maintenant afin de confirmer ce résultat in silico pour la structure du RRM2. L'analyse du spectre 'H-15N HSQC de la protéine RRM2 a permis de voir que les
résonances amides du motif présentaient une belle dispersion suggérant que la protéine soit effectivement repliée. De plus, en accord avec son modèle par homologie, un spectre DC de ce motif dévoile un patron typique des protéines possédant des structures d'hélice- a et de feuillet-0 séparées (Manavalan and Johnson, 1983). Ces résultats constituent les premières observations réalisées sur le RRM2 de p54nrb qui démontrent que ce polypeptide est réellement replié et qu'il adopte possiblement la conformation attendue pour un RRM. Par contre, des études plus approfondies, par RMN ou diffraction des rayons X, sont requises afin de vérifier la topologie du motif. Comme les spectres 3D nécessaires à l'attribution du squelette du RRM2 ont été enregistrés (HNCO, HNCA, HNCOCA, CBCACONH), l'attribution du motif et l'analyse de l'index des déplacements chimiques (Wishart and Sykes, 1994) des résonances des Ca, C0 et CO pourrait être un des moyens utilisé pour déterminer la topologie du RRM2. La topologie obtenue par RMN pour le RRM2 pourrait par la suite être comparée avec celle de son modèle par homologie.
L'analyse des spectres 'H-15N HSQC et 3D HNCO du RRM2 a révélé la présence de plus
de pics que la valeur théorique attendue pour ces spectres. En effet, le 'H-15N HSQC et le
HNCO présentent respectivement environ 110 et 120 pics alors que 102 pics sont théoriquement attendus pour ces spectres. Comme cette protéine agrège en fonction du temps, ce nombre de pics trop élevé pourrait être dû à un échange conformationnel lent entre la forme agrégée et la forme soluble du motif. Un tel échange ferait en sorte que les pics des résidus impliqués dans l'échange seraient potentiellement dédoublés expliquant ce nombre de pics trop élevé.
4.2 Caractérisation de la liaison des segments protéiques du DLA de p54nrb à l'ARN
Le deuxième volet du projet a porté sur la caractérisation de la liaison des différentes fractions du DLA de p54nrb à l'ARN du 5'SS et à des ARNs de polyguanosines. Le RRMl de p54nrb possède toutes les caractéristiques d'un RRM classique pouvant lier l'ARN. En effet, ce motif contient les 3 résidus aromatiques conservés des RNPs en surface de son feuillet-P qui permettent normalement au RRM d'interagir avec l'ARN (figure 7). De son côté, le RRM2 ne possède pas ces résidus aromatiques conservés. À la lumière de ces observations, une de nos hypothèses de départ était que le RRMl de p54nrb était celui responsable de l'interaction de la protéine à l'ARN.
4.2.1 Le RRMl est le motif de p54nrb responsable de sa liaison à l'ARN
Les différents tests de liaison à l'ARN in vitro réalisés avec les segments protéiques du DLA de p54nrb ont démontré que le RRM2 de p54nrb seul était incapable de lier l'ARN du 5'SS et les homoribopolymères de guanosines contrairement aux constructions N- RRM1/2 et N-RRMl (figures 18 et 22). De plus, des spectres 'H-^N HSQC réalisés sur des échantillons du N-RRMl ou du RRM2 contenant le ligand du 5'SS ou du polyG ont permis de confirmer ces tests de liaison in vitro. En effet, plusieurs résonances amides du N-RRMl ont été perturbées par l'ajout des ligands contrairement à ce qui a été observé pour le RRM2. D'ailleurs, il est intéressant de noter que les mêmes résultats ont été observés suite à des tests de liaison in vitro et par RMN des différents fragments du DLA à des homoribopolymères d'adénosine (~ 100 -1000 nucleotides, Sigma-Aldrich) (annexe
E). L'analyse des résonances amides du N-RRMl perturbé suite à l'ajout des différents ligands a révélé que les résidus impliqués dans les interactions N-RRMl/ARN étaient en majorité ceux du RRMl alors que le N-terminal semblait peu impliqué. Ces résultats ont appuyé notre hypothèse initiale en démontrant que le RRMl de p54nrb était le motif responsable de l'interaction de p54nrb avec les différents ARNs testés.
Dans la littérature, il y a de plus en plus d'exemples qui démontrent que certains RRMs en tandem lient un ligand d'ARN ou d'ADN simple brin de façon coopérative afin d'augmenter la spécificité et l'affinité de la liaison (Allain et al., 2000; Deo et al., 1999; Ding et al., 1999; Handa et al., 1999; Johansson et al., 2004; Oberstrass et al., 2005). Comme le RRM2 de p54nrb semble incapable de lier l'ARN lorsqu'il est seul, nous avons voulu vérifier si ce phénomène de coopérativité de liaison pouvait s'appliquer aux RRMs de p54nrb. Afin de vérifier cette hypothèse, des 'H-15N HSQC ont été enregistrés
sur des échantillons RMN contenant du RRM2 marqué, du N-RRMl non marqué et les différents ligands d'ARN (figure 19C et 23C). Ces expériences ont permis de constater que les deux RRMs de p54nrb n'interagissent pas ensemble et que la présence du RRMl n'affecte pas la liaison du RRM2 à l'ARN. Il semblerait donc que le RRM2 non classique de p54nrb soit incapable de lier l'ARN en présence ou en absence du RRMl.
Une étude parue en 2006 a démontré que p54nrb se retrouve dans un complexe nucléaire comprenant PSF, la protéine de nucléation de Tacrine N-WASP, de l'actine nucléaire et la Pol II (Wu et al., 2006). De plus, une interaction directe entre le RRM2 de p54nrb et N-WASP a été observée. Les auteurs ont démontré que cette interaction était nécessaire afin de permettre une transcription efficace par la Pol II dans des cellules eucaryotes. Bien que les RRMs soient reconnus comme des motifs de liaison à l'ARN, beaucoup d'exemples de RRMs impliqués dans des interactions de type protéine/protéine ont été reportés dans les dernières années (Bono et al., 2004; Calero et al., 2002; ElAntak et al., 2007; Kadlec et al., 2004; Price et al., 1998; Selenko et al., 2003). Comme la liaison du RRM2 à la protéine nucléaire N-WASP a été documentée, l'attribution des résonances du squelette du RRM2 de p54nrb et la caractérisation de sa liaison avec N-WASP par RMN pourrait contribuer à augmenter la compréhension des RRMs liant des protéines.
4.2.2 Le RRMl de p54nrb lie le 5'SS et le polyG par deux sites de liaison distincts Après avoir démontré que le RRMl était le motif de p54nrb responsable de son interaction avec les ARNs testés, notre objectif a été de définir les sites de liaison et les affinités du motif pour l'ARN du 5'SS et pour le polyG. En effet, nous avons récemment observé que la phosphorylation de la threonine 15 de p54nrb inhibait son interaction avec l'ARN du 5'SS, mais n'avait pas d'impact sur sa liaison avec l'ARN riche en G NEAT1 ou avec des ARNs de polyguanosines (Bruelle et al., sous presse, voir annexe A). Basé sur ces résultats, notre hypothèse initiale était que la liaison de p54nrb au 5'SS et au polyG présente des caractéristiques différentes. Afin de vérifier cette hypothèse, les deux ligands d'ARN ont été titrés dans des échantillons protéiques du N-RRMl et les perturbations des résonances amides du RRMl ont été analysées.
La liaison de p54nrb au site d'épissage en 5' et à différentes composantes de la machinerie de transcription et d'épissage a été documentée dans la littérature et a permis d'établir une fonction de cette protéine dans le couplage de la transcription et de l'épissage (Emili et al., 2002; Kameoka et al., 2004; Peng et al., 2002). L'expérience de titration du 5'SS a révélé que le RRMl de p54nrb lie cet ARN par un site de liaison classique faisant intervenir 2 des 3 résidus aromatiques conservés du motif (figure 20). En effet, les phenylalanines en position 3 et 5 (FI 13 et FI 15) du RNP1 du RRMl de p54nrb ont montré des CDCs significatifs suite à l'ajout du 5'SS suggérant qu'elles soient directement impliquées dans l'interaction. Pour sa part, la phenylalanine en position 2 du RNP2 (F79) a montré des CDCs plus grands que la moyenne des CDCs du RRMl lors de la titration, mais plus petits que le seuil de significativité établie. Ces résultats suggèrent donc que le résidu F79 est peu ou pas impliqué dans l'interaction. Par contre, comme l'analyse des CDCs des résonances amides pour cartographier une interaction protéine/ligand demeure une approximation, des études supplémentaires seraient requises afin de vérifier la réelle implication des 3 phenylalanines conservées. Réaliser la structure du complexe N-RRMl/5'SS par RMN ou par diffraction des rayons X serait la solution idéale pour vérifier la réelle implication de ces différents résidus dans l'interaction. Un autre moyen plus simple et plus rapide serait de vérifier les CDCs des
résonances des atomes des chaînes latérales suite à la titration plutôt que de regarder les CDCs des résonances amides peu sensibles à la liaison du ligand.
Dans plusieurs exemples classiques de liaison des RRMs aux acides nucléiques, le résidu basique conservé en position 1 du RNP1 forme un pont salin avec le squelette de phosphate du ligand (Ding et al., 1999). Malheureusement, comme nous n'avions pas l'attribution des résonances amides de la boucle 3 du RRMl de p54nrb, l'implication de la lysine 111 conservée du motif (position 1 du RNP1) dans sa liaison au 5'SS n'a pu être vérifiée. Mesurer l'effet de diverses mutations de la lysine 111 sur l'affinité du RRMl pour le 5'SS pourrait être un des moyens utilisé pour déterminer le rôle de cette lysine dans l'interaction. Bien qu'aucune information concernant l'implication de la lysine 111 dans l'interaction n'ait pu être recueillie, 2 autres résidus basiques du brin 04 (R142 et R144) ont montré des CDCs significatifs suite à l'ajout du 5'SS (figure 20). Ces résultats suggèrent que ces résidus sont potentiellement impliqués dans des interactions électrostatiques avec le ligand.
La liaison de p54nrb à l'ARN riche en G NEAT1 est essentielle au maintien de l'intégrité des paraspeckles, un compartiment nucléaire impliqué dans la rétention des ARNs hyper- édités (Chen and Carmichael, 2009; Sasaki et al., 2009). Dernièrement, nous avons observé in vitro et in vivo que la liaison de p54nrb à NEAT1 n'était pas régulée par sa phosphorylation mitotique contrairement à ce qui a été observé pour sa liaison aux ARNs en générale (Bruelle et al., sous presse, voir annexe A). Les mêmes résultats ont été observés in vitro avec des homoribopolymères de G suggérant que la haute teneur en G de NEAT1 soit responsable de cette différence de régulation. Les résultats obtenus lors de la titration du polyG dans l'échantillon protéique du N-RRMl ont démontré que la liaison du RRMl à ce ligand se faisait par un site de liaison non classique différent de celui utilisé pour lier le 5'SS (figure 25). En effet, aucun des résidus aromatiques conservés des RNPs n'a démontré de perturbations significatives suite à l'ajout du ligand. De plus, seulement 2 des 13 résidus (L78 et RI 17) significativement perturbés suite à l'ajout du polyG font partie des séquences des RNPs du RRMl comparativement à 6 des 11 résidus (L78, V80, G81, FI 13, G114 et FI 15) identifiés pour la liaison du motif au 5'SS.
L'analyse des CDCs lors de la titration a aussi permis de voir que 2 résidus de la boucle 2 (Kl 01 et A102) et de la boucle 4 (Ll 18 et T120) de même que 2 résidus juste en amont du RRMl (F2 et T73) ont été perturbés par l'ajout du polyG. Ces résultats démontrent une fois de plus que le site de liaison du polyG au RRMl est non classique car il n'implique pas seulement des résidus du feuillet-0 contrairement à ce qui a été observé pour la liaison du RRMl au 5'SS (figure 20B).
Il est intéressant de noter que la caractérisation de la liaison des quasis RRMs (qRRM) de la protéine hnRNP F à des ARNs comportant des suites de guanosines a aussi révélé des sites de liaison non classiques (Dominguez and Allain, 2006). En effet, tout comme pour la liaison du RRMl de p54nrb au polyG, plusieurs résidus impliqués dans l'interaction de ces qRRMs avec le ligand n'étaient pas des résidus des RNPs ou du feuillet-0. Dans cette étude, les auteurs ont démontré que leur ligand était capable de former des structures de G-quadruplex. Ils ont donc émis l'hypothèse que la liaison non classique des qRRMs de hnRNP F à ce ligand était causée par la présence de ces structures de G-quadruplex. Une analyse du polyG avec l'outil de prédiction de structure de G-quadruplex quadparser (Scaria et al., 2006) révèle que ce ligand forme possiblement ce type de structure. Il serait intéressant de vérifier si la liaison du RRMl de p54nrb au polyG par son site non classique est dépendante de la présence de structures de G-quadruplex et de voir si ces structures sont conservées suite à la liaison. De plus en plus d'études tendent à démontrer l'importance des structures de G-quadruplex dans plusieurs processus cellulaires tels que la régulation de la transcription et de la traduction et la régulation de l'épissage alternatif (Huppert, 2008). L'étude de la liaison du RRMl de p54nrb aux ARNs de polyguanosines pourrait donc potentiellement contribuer à identifier les caractéristiques des RRMs capable de lier des structures de G-quadruplex. Finalement, une prédiction de G- quadruplex réalisée sur l'ARNnc NEAT1 a aussi permis de voir que cette ARN pouvait potentiellement former 35 de ces structures (Bruelle et al., sous presse, voir annexe A). Il serait donc intéressant de caractériser la liaison du RRMl de p54nrb à cet ARN afin de voir si la liaison se fait aussi par le site non classique du RRMl de p54nrb.
En accord avec notre hypothèse initiale qui voulait que la liaison de p54nrb au 5'SS et au polyG présente des caractéristiques différentes, un site de liaison unique a été identifié pour chacune de ces molécules d'ARN (figure 25). Malgré la différence des résidus impliqués dans la liaison du RRMl à ces 2 ligands, plusieurs des résidus identifiés exposant leur chaîne latérale à la surface de la protéine aux différents sites de liaison se sont avérés être basiques ou aromatiques. Pour le site de liaison du 5'SS et du polyG respectivement, 4 des 5 (FI 13, FI 15, R142 et R144) et 5 des 8 (F72, R77, K94, K101 et RI 17) résidus exposant leur chaine latérale en surface des sites de liaison sont basiques ou aromatiques (figure 25). Conformément à ce qui est connu pour les RRMs dans la littérature, les résidus aromatiques identifiés pourraient potentiellement être impliqués dans des interactions d'empilement avec l'ARN alors que les résidus basiques forment possiblement des interactions électrostatiques ou des ponts hydrogènes avec le ligand. Finalement, le calcul du potentiel électrostatique de surface du RRMl permet de voir que les deux sites de liaison sont situés dans une portion plutôt basique de la protéine et constituent donc par le fait même des plateformes idéales pour accueillir un acide nucléique chargé négativement (figure 25).
Les expériences de titration du 5'SS et du polyG ont permis d'approximer l'affinité du