Etude 2 : Suivi du Faisceau Cortico Spinal chez le marmouset par une technique d’IRM III. Discussion complémentaire : A propos des risques opératoires : Les premières anesthésies sans intubation ont été faites sans mise à la diète la veille. Suite à la mort d’un animal quelques jours après une opération, une autopsie a montré l’obstruction des poumons suite à une régurgitation probablement pendant une anesthésie (une IRM ou une chirurgie). Une diète la veille a été instaurée pour les suivants et l’intubation n’a été requise pour aucune autre anesthésie. Un animal faisant une réaction œdémateuse des téguments vraisemblablement expliquée par une allergie à la Terramycine après une opération pour l’injection de MnCl2 est décédé d’une hypoxie sévère et a été retiré du protocole. A propos de la spécificité du manganèse comme traceur neuronal : Selon Pautler (Pautler et al., 1998), le Mn2+ agit comme un traceur de faisceau neuronal. Le marquage au manganèse a été validé par des expériences avec des traceurs conventionnels. Par exemple, chez le rat, l’organisation topographique du faisceau thalamo-cortical a été révélé par l’injection du traceur rétrograde « Biotinylated Dextran Amine » (BDA) dans le cortex S1. Les deux méthodes ont induit un marquage du cortex somato-sensoriel secondaire, du corps calleux, du S1 controlatéral et du thalamus (Leergaard, 2003). Une validation identique a été réalisée par Dyrby et al., sur les faisceaux provenant du cortex moteur, du cortex somatosensoriel et du cortex préfrontal, chez le mini-porc (Dyrby et al., 2007). Murayama et al., ont vérifié chez le singe rhésus, la spécificité du Mn2+ comme traceur neuronal par l’injection de WGA-HRP (wheat-germ-agglutinin conjugated to horseradish peroxidase) dans le putamen ou le noyau caudé aux même coordonnées stéréotaxiques que le MnCl2 (Murayama et al., 2006). Cette dernière étude montre clairement l’utilisation possible de MnCl2 comme traceur neuronal. Enfin, la transposition de notre marquage sur le cerveau moyen de référence et la comparaison avec l’atlas de marmouset montre des marquages dans des directions bien spécifiques qui suivent des trajectoires distinctes et confirme donc la spécificité du marquage du FCS chez le marmouset. Même si notre objectif principal était de tracer le FCS, nous devons souligner que le manganèse a marqué également d’autres faisceaux provenant de M1 comme le faisceau cortico-putaminal et le faisceau cortico-thalamique. De plus, la propagation active (ou passive) du manganèse dans le cortex 76 ne marque pas seulement M1 mais aussi, dans une plus faible proportion, les cortex secondaires qui sont : le cingulum, le cortex pré-moteur ainsi que le cortex sensorial primaire et le cortex pariétal. Par conséquent, les structures sous corticales suivantes sont marquées : le noyau caudé, le putamen, le thalamus par ces connections. Enfin le manganèse peut passer les synapses, ainsi le globus pallidus et le thalamus ont pu être marqués via la boucle de contrôle cortico-putamino-pallido-thalamique et la substance noire via les connections striatales. Nos travaux ont été axés sur l’étude comportementale et sur l’imagerie IRM. Bien que les analyses histologiques soient la référence pour valider ce que nous marquons, elles auraient étaient couteuses en terme d’effectif d’animaux sacrifiés. Devant l’exacte correspondance entre nos résultats et l’atlas, et au vu de la littérature qui montre à ces faibles doses ni lésion ni inflammation (Canals et al., 2008), nous avons décidé de ne pas faire d’histologie pour cette étude. La dernière raison est que ces animaux doivent être inclus dans une autre étude pour déterminer l’intégrité du FCS après une lésion de M1. A propos de l’artéfact induit par le manganèse Nous avons pu vérifier à postériori la précision de notre injection d’une part sur la coupe présentant le volume maximum d’hyper-intensité attendu sur la coupe où la commissure antérieure est visible, 6 mm en avant de Bregma (Figure 15) et d’autre part lorsque l’artéfact dû à une hyper-concentration de manganèse est visible. Sur le marmouset injecté avec une forte dose de 400 nmol, présenté dans l’article figure 2B, le cœur de l’injection (là où peut se former un artéfact aux fortes doses) est observé à 4 mm (Figure 2B de l’article) au lieu de 6 mm en avant de bregma. Un léger déplacement du site d’injection s’est vraisemblablement produit pour ce marmouset en particulier dont le site d’injection est autour de 4-5 mm en avant de Bregma. Mais, pour l’étude principale de l’article, nous n’avons pas testé cette forte dose, à cause du marquage trop étendu et non spécifique. De plus, aucun artéfact n’a été observé chez les marmousets injecté avec la petite dose (8 nmol) et le site d’injection est confirmé à environ 6 mm en avant de Bregma (Figure 15). Les images ont été choisies à leur maximum d’intensité en cortical et nous observons sur les coupes la commissure antérieure qui se trouve à 6 mm en avant de Bregma (flèche blanche). 77 Figure 15 : IRM T1 montrant les sites d’injections des 7 marmousets, marqués au manganèse par la petite dose (8nmol). Le Manganèse est injecté au niveau du cortex moteur primaire, +6mm en avant de Bregma, +4,5mm en latéral (dans l’hémisphère opposé à la patte dominante) et -2,5mm en profondeur. L’IRM pondérée en T1 est prise 24h après l’injection La relation entre la présence d’un artéfact et un déficit moteur transitoire associé, peut être reliée à l’accumulation transitoire de manganèse dans le cortex moteur. Notre étude est la première à explorer le comportement moteur après une injection locale de manganèse et pourrait ouvrir la voie à de futures études manganèse/comportement. Cependant, notre but était de choisir une dose très faible ne donnant aucun artéfact, ce qui est montré Figure 15, dans le but de ne pas endommager le tissu cérébral et de ne pas perturber le comportement moteur. A propos de la diffusion dans le cortex, aux fortes doses avec un volume constant. Deux aspects sont à prendre en considération, la diffusion passive dans l’espace extracellulaire et le marquage des connections cortico-corticales. En ce qui concerne la diffusion du manganèse dans le cortex, et étant donné les estimations de Nicholson et Sykova’s qui sont basées sur le coefficient de diffusion apparent calculé pour la diffusion extracellulaire de l’eau dans des tranches de tissu cortical (Nicholson and Syková, 1998), le manganèse peut diffuser jusqu’à 6 mm en 10h (Leergaard, 2003, 8 nmol avec un petit volume d’injection de 10 nL et chez un petit animal, le rat). Dans notre cas, 24h après l’injection, nous observons une propagation du marquage qui augmente avec la dose avec un rayon de 5-6 mm pour la plus forte dose (800 nmol). Ainsi nous pouvons interpréter ce large marquage cortical « sphérique » par de la diffusion passive. La captation active du manganèse par les cellules et le traçage des connections horizontales cortico-corticales ne semble pas élargir la « sphère ». 78 Le marquage n’a pas une forme totalement sphérique puisque qu’il s’arrête au plan sagittal de l’hémisphère au niveau cortical. Au niveau du corps calleux, nous avons observé un marquage du manganèse se dirigeant vers l’autre hémisphère. De plus, le marquage est similaire aux autres larges marquages vus dans la littérature chez les rongeurs injectés dans le cortex. Pour la plus faible dose (8 nmol), la propagation corticale est inférieure à 4 mm de rayon dans la direction antéro-postérieure (les coupes 4.4 et 6.1 mm affiche un marquage cortical alors que les 2.2 et 8.2 mm non, Figure 3 de l’article). Ainsi, une propagation du manganèse de 4 mm de rayon dans le cortex semble être très restreinte et les connections cortico-corticales semblent être courtes. Enfin, le marquage vu à un seuil statistique plus bas montre un marquage qui s’étend vers l’avant et vers l’arrière et qui n’est absolument pas sphérique. Il pourrait témoigner de connections cortico-corticales antéro-postérieures. Concernant la possibilité d’avoir une meilleure définition du faisceau allant du site d’injection aux pédoncules cérébraux : Même si notre objectif principal était de tracer le FCS, nous devons souligner que, de toute évidence, le manganèse marque également d’autres faisceaux provenant de M1 comme le faisceau cortico-putaminal et le faisceau cortico-thalamique (Jones et al., 1977; Kemp and Powell, 1970; Künzle, 1975). Nous n’avons pas trouvé de références sur ces faisceaux chez le marmouset. Cependant, les références sont fournies pour le singe écureuil, le rhésus et le macaque, et ces faisceaux sont largement préservés du rongeur à l’homme. La finesse (définition) attendu du faisceau ne peut pas être meilleure même à la plus petite dose. Nous fournissons ici deux exemples de faisceaux bien définis à la petite dose (Figure 16) et c’est ce qui ressort, de manière claire, en jaune sur la carte statistique figure 3 de l’article. 79 Le marquage s’élargit à partir de la capsule interne vers le putamen d’un côté et le thalamus de l’autre. Figure 16 : Marquage du FCS de marmouset par le manganèse à petite dose (8 nmol) Coupe coronale de marmouset d’une IRM pondérée T1, 24h après l’injection de MnCl2 (8 nmol). A gauche les images brutes et à droite les images seuillées sur Image J pour souligner le marquage.du FCS. A propos de la profondeur du marquage Statistiquement, au niveau du groupe, nous n’avons pas trouvé d’hypersignal dans les pyramides dû au manganèse mais individuellement, un animal avait du signal jusque dans les pyramides (Figure 17 A).En comparaison, avec la forte dose nous arrivons plus profondément dans les pyramides voire après la décussation du FCS mais la perte de spécificité dans le cerveau nous a poussé à choisir la petite dose (Figure 17 B et C). 80 B X = 1.4 Y = -2.3 Z = -1.95 A X = 1.5 Y = -0.3 Z = 2.75 C X = -0.3 Y = -10.3 Z = -13.35 Figure 17 : Images brutes de cerveau de marmouset en IRM T1, montrant un hyper signal, induit par le manganèse, dans les pyramides et dans la moelle. Coupes en sagittal, coronal, et axial montrant un hypersignal dans les pyramides à différentes doses de manganèse. A. Dose de 8nmol, B. et C. dose de 800nmol. Les coordonnées sont données en mm avec comme origine la commissure antérieure (même niveau antéro-postérieur que le site d’injection). Les lignes bleues montrent le signal de manganèse au niveau des pyramides : dans le tronc cérébral A et B et après la décussation C dans la moelle. 81 Dans le document Preuve de concept d'une stratégie thérapeutique avec des neuro-implants microstructurés dans un nouveau modèle de lésion cérébrale focale chez le marmouset (Page 97-103)
