Chirurgies

Les marmousets étaient mis à jeun 12h avant la chirurgie. Ils gardaient un accès libre au

biberon d’eau. Dix minutes avant l’anesthésie, 20 µg/kg d’une solution de glycopyrrolate

(Robinul-V®, Vetoquinol, Lure, France) était injectée en intramusculaire (IM) sous contention

manuelle. Une anesthésie légère était induite par une injection IM d’Alfaxalone à 7 mg/kg

(Alfaxan®, Worcestershire, UK). Tous les marmousets ont ensuite reçu une prémédication par

injection IM de : Oxytétracycline (20 µg/kg, Terramycine longue action®, Pfizer, Paris, France),

Buprénorphine (25 µg/kg, Vétergesic®, Reckitt Benckiser Healthcare, Danson, UK),

Méthylprednisolone (5 mg/kg, Solu-médrol®).

Premièrement, la tête est rasée avec une tondeuse chirurgicale et le scalp est tondu avec un

rasoir à lame. La saturation en oxygène du sang, la fréquence respiratoire et la fréquence

cardiaque sont monitorées sur la totalité de la procédure chirurgicale (Starr Life Science,

Oakmont, PA, USA). Un tapis chauffant couplé à une sonde rectale permet le maintien de la

température à 37,5 ± 0,5°C. Les animaux sont placés sur barres d’oreille dans un cadre

stéréotaxique rat, adapté pour le marmouset en ce qui concerne la forme et la taille des barres

d’oreilles. Ils ont une anesthésie gazeuse pour la suite de la chirurgie avec 2% d’isoflurane dans

80% O

2

/20% air. La saturation en oxygène doit être maintenue au-dessus de 95%. Une stérilisation

minutieuse de la peau du crâne est réalisée par trois lavages Bétadine/alcool 70%. Une incision de 2

cm dans le scalp est faite suivie du fraisage du crâne aux coordonnées en regard du cortex moteur

primaire de la patte avant et donc du site d’injection : 6 mm en avant et 4,5 mm en latéral par rapport

au Bregma, en accord avec l’Atlas stéréotaxique du cerveau de marmouset (Yuasa et al., 2010). Afin

de permettre une injection intracérébrale, un fraisage de l’os est effectué avec une

tête « diamant » de 1 mm de diamètre et après incision de la dure-mère, l’aiguille est

enfoncée de 2,5 mm par rapport à la surface. Pour l’implantation des prothèses c’est un volet

crânien de 5 mm de diamètre, centré sur le site d’injection, qui est réalisé.

Lésion

Afin d’induire la lésion, le malonate (Sigma Aldrich, France) est délivré à l’aide d’une seringue

Hamilton (série 701N) de 10 μL, équipée d’une aiguille avec un diamètre externe de 0,485mm

(Phymep, Paris, France), à un débit de 1 μL/min grâce à un micro-injecteur (KDS 310, Phymep).

L’aiguille est maintenue en place pendant cinq minutes après l’injection afin d’éviter une

résurgence du produit. Un premier animal a été injecté avec une faible dose de malonate (4μL

à 3M, dose que l’on injectait habituellement chez le rat). Aucun déficit n’ayant été constaté et

la lésion étant très limitée en taille, la dose et le volume ont été augmentés à 8μL d’une

solution à 3M pour les marmousets suivants. La lésion est effectuée dans l’hémisphère

contrôlant la patte dominante du marmouset. Le trou dans le crâne est comblé par du ciment

dentaire (Paladur, Heraeus, Germany). Enfin, l’aponévrose épicrânienne (galea aponeurotica)

et la peau sont suturées respectivement par des fils 5/0 et 3/0 (Vicryl). L’isoflurane est coupé

et l’oxygène maintenue jusqu’au premiers signes de réveil. Les marmousets sont remis dans

leur cage avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau.

L’hémisphère ciblé correspond à l’hémisphère controlatéral à la patte dominante, déterminée

en fonction des performances aux tests comportementaux. La patte dominante est

déterminée par celle présentant les meilleures performances d’agilité, rapidité, force et

dextérité. Les mesures seront donc plus sensibles et l’impact des lésions sur les performances

plus évident.

Chlorure de Manganèse (MnCl

2

)

Pour marquer le FCS, une solution de MnCl2 (Sigma Aldrich, France) 0.05M (n=9) est injectée

dans un volume de 0,16µl, soit une dose de 8 nmol. La solution est délivrée à un débit de 0,02

μL/min grâce à un micro-injecteur et d’une seringue Hamilton (série 701N) de 5 μL, équipée

d’une aiguille avec un diamètre externe de 0,22mm (Phymep, Paris, France). L’aiguille est

maintenue en place pendant cinq minutes après l’injection afin d’éviter une résurgence du

produit. Le trou et la peau sont refermés de la même manière que pour la lésion et la fin de la

chirurgie reste la même.

Implantation des biomatériaux et traitement à la Chondroitinase.

Une semaine après la lésion trois individus, J, K et L, ont reçu un traitement couplant la greffe

de prothèses micro-structurées avec l’injection d’une enzyme dégradant les protéoglycansà

chondroïtine sulfate, macromolécules glucidiques de la matrice extracellulaire : la

chondroïtinase ABC (12 U/ml; Sigma). La conception des prothèses est pleinement décrite

dans l’article d’Amélie Béduer (Béduer et al., 2012) qui a conçu ces prothèses et m’a transmis

la méthode de fabrication. Pour résumer, les implants sont en polydimethylsiloxane (PDMS),

un polymère inerte et non-cytotoxique. Ils sont créés par cinq à partir d’un timbre. Ce timbre

s’obtient en moulant le PDMS sur un moule de silicium qui a l’architecture souhaitée (rainures

de dimensions optimisées pour les cellules neurales) par une technique de photolithographie.

On dépose 100 µL de PDMS sur le moule. L’ensemble est chauffé à 80°C pendant 2h pour que

le PDMS réticule. Deux timbres sont collés dos à dos pour obtenir des implants

micro-structurés sur les deux faces et avoir une épaisseur d’environ 250 µm. Les cinq prothèses sont

coupées dans le timbre puis un traitement doux au plasma à oxygène permet d’activer les

surfaces. Cette dernière étape permet le « coating » des prothèses avec de la polylysine et de

la laminine qui favorise l’adhérence cellulaire. L’épaisseur est mesurée à postériori, les timbres

trop épais sont exclus et l’épaisseur des implants étaient de 250µm ±10%.

La chirurgie d’implantation se réalise comme les précédentes. Une fois le volet crânien retiré,

et la dure-mère incisée, une partie du tissu lésé est retirée, soit environ 10 mm

3

pour

compenser le volume de prothèses, 12,5 mm

3

, qui seront implantées. Les 5 prothèses sont

fabriquées à la dimension 5x2x0,25 mm sur un moule mis au point pour le rat (conception

LAAS). Pour le rat, les prothèses étaient coupées à 4 mm de longueur. Au vu de la taille des

lésions chez le marmouset, une longueur de 5 mm nous paraissait adaptée pour le

marmouset. Les 5 prothèses de dimension 5x2x0,25 mm sont disposées dans la lésion en

évitant au mieux quelles se chevauchent. La solution de chondroïtinase est délivrée avec une

seringue Hamilton (série 701N) de 10 μL, équipée d’une aiguille avec un diamètre externe de

0,22mm (Phymep, Paris, France), à un débit de 1,5 μL/min grâce à un micro-injecteur, en deux

sites d’injection dans la lésion, à raison de 2 x 10 µL, soit une dose de 240mU. L’aiguille est

maintenue en place pendant cinq minutes après les injections afin d’éviter une résurgence du

produit.

Le suivi post-opératoire était de base le même pour tous les animaux, avec à 24h, une injection

IM de 0,04 ml de tolfédine et 0,1 ml de solumédrol, à 48h une nouvelle injection de tolfédine

qui pour les plus impactés était remplacée par du vétergésic 0,03 ml. 72h post opératoire un

antibiotique est administré par IM : 0.04 ml de terramycine LA.

Dans le document Preuve de concept d'une stratégie thérapeutique avec des neuro-implants microstructurés dans un nouveau modèle de lésion cérébrale focale chez le marmouset (Page 115-118)