3. Différentes Techniques réalisées au laboratoire

II- 3.1. Techniques de mise en évidence de la PrPsc

La PrPsc constitue le marqueur idéal en termes de spécificité. [49]

Plusieurs techniques permettent la mise en évidence de la PrPsc, les plus utilisées sont le Western Blot et l'immunohistochimie.

II. 3 .1. 1. Immunohistochimie (IHC).

L'IHC est très largement utilisée dans une majorité de laboratoires d'anatomie Pathologie. [53]

 Principe

Elle consiste à mettre en évidence la PrPsc grâce à un anticorps (Ac) spécifique après prétraitement à l'acide formique et à la Protéinase K, cet anticorps est couplé à un traceur(enzyme ou substance fluorescente). La réaction (Ac-Ag) se fait sur des coupes de tissus congelés ou fixés et inclus en paraffine

Fig. 9: Principe général de l'immunohistochimie [53]

 Méthodes de révélation

L'immunofluorescence directe est surtout utilisée pour révéler les dépôts tissulaires de la PrPsc dans les biopsies de cerveau ou d’amygdale, observées grâce à un microscope à fluorescence. Dans les méthodes immunoenzymatiques, l' Ac est couplé à une enzyme (peroxydase, phosphatase alcaline) à laquelle on fournit son substrat (ex : diaminobenzidine ou amino-ethyl carbazol pour la peroxydase, système NBT- BCIP pour la phosphatase alcaline). Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des complexes Ag-Ac. [53]

 Lecture

L’accumulation de la PrPsc sur coupe tissulaire cérébrale est mise en évidence sous forme de plaques amyloïdes ou bien d’un marquage diffus (Fig.

10). La vMCJ se caractérise par la présence de plaques amyloïdes constituées

de PrPsc centrés sur une bulle de spongiose appelée plaques florides ou plaques en « marguerite » [42]. Cependant l’intensité de l’accumulation de PrPsc, le type d’Ac utilisé, la nature de protocole de prétraitement des lames et l’expérience de manipulateur sont des facteurs de variabilité des résultats qui ne doivent pas conduire à un rejet du diagnostic lorsque l’immunomarquage se révèle négatif.

[50]

 Avantages

- Préservation de la morphologie tissulaire; - Très bonne spécifité. (99%) [163]

 Inconvénients

- Difficultté de lecture;

- Grands nombre de coupes tissulaires nécessaires; - Résultat variable (Qualité de l'anticorps).

Fig. 10: plaques amyloïdes multicentriques dans le cervelet d'un patient atteint de Syndrome de Gerstmann-Sträussler- Scheinker marquées par un

I- 3. 1. 2 Western blot (WB)

Cette technique permet la détection immunologique d'une protéine contenue dans un extrait protéique.

 Principe :

L'extrait protéique doit tout d'abord être déposé sur un gel dénaturant

SDS-PAGE (SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Les protéines de l'extrait sont séparées en fonction de leur masse moléculaire par électrophorèse. Après migration, les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF (PolyVinylidine DiFluoride). L'immunodétection est ensuite réalisée sur la membrane à l'aide d'un anticorps primaire dirigé contre la protéine recherchée. Après incubation de la membrane avec l'anticorps secondaire correspondant et couplé à un marqueur, les protéines reconnues par l'anticorps primaire sont visualisées par chimioluminescence (Fig. 11). [51]

Fig. 11 : Schéma du WB [51]

Dans le cas de recherche des PrPsc cette technique repose essentiellement sur la sensibilité différentielle à la digestion enzymatique par la PK, des formes normales et pathologiques de la PrP. Le tissu est homogénéisé puis incubé en présence de PK, enfin seul la PrPsc, du fait de sa résistance à la PK, est détectable et classiquement identifiée sous la forme de trois bandes dont le poids moléculaire apparent est compris entre 20 et 30 KDa (contre 33-35KDa de la forme non digérée). Ces trois bandes correspondent aux formes di-, mono

Fig. 12: Immunodétection de la PrP par WB [43]

 Typage de la PrPsc

L’analyse en WB a permet de mettre en évidence quatres variants (souches) du prion qui se distinguent les uns des autres par leurs poids moléculaires apparents et /ou l’intensité des trois glycoformes, cette diversité reflète probablement l’existence de différents conformations de PrPsc (Fig.13). La notion de souche a un intérêt à la fois épidémiologique et diagnostique par détermination étiologique de la forme présentée par le malade. [43]

Fig. 13 : Caractérisation des différents types de PrPsc par WB [55] Quatre types de profils ont été reconnus jusqu’à présent : - Type 1 et 2 : MCJ sporadique

- Type 3 : MCJ iatrogène - Type 4: vMCJ

 Avantages - Sensibilité :

• Faible quantité d’antigène détectable ; • Faible quantité d’anticorps requise. -Hautement résolutive :

• Signal facilement quantifiable ; • Fort contraste.

 Inconvénients

- Technique semi-quantitative ;

- Sensibilité variable (spécificité et qualité de l’anticorps).

 Spécificité et sensibilité

La spécificité de la recherche de PrPsc par immunotransfert est de 100%, sa sensibilité n’a pas été évaluée, mais il existe quelques situations de faux négatif. La qualité de l’anticorps revêt ici encore une importance capitale. La mise à disposition d’un anticorps monoclonale, appelé 3F4,a permis d’améliorer les performances de l’immunotransfert. [43]

II.3.1.3 Technique d'amplification " protein mysfolding cycling

amplification" (PMCA)

Cette technique novatrice permet de détecter des concentrations extrêmement faibles de prion anormal en augmentant le nombre initial de PrPsc dans l’échantillon. Elle s’apparente au principe de la "polymerase chain reaction" (PCR), avec une succession de phases d’amplification entre-coupées de phases de sonication. Ces amplifications ont pour résultat de convertir la PrPc en protéine prion anormale PrPsc. D’après les résultats, 97 % des PrPsc retrouvées après cette amplification seraient le résultat de protéines nouvellement converties. Cette technique permet donc d’augmenter la quantité de PrPsc dans un prélèvement et ainsi diminuer indirectement le seuil de détection des tests actuels. Couplée aux méthodes d’immunodétection actuelle, la PMCA pourrait être utilisée pour la détection des protéines prions anormales dans les tissus ou dans les liquides biologiques. [56]

II. 3. 1 .4. Autres techniques

D’autres techniques plus ou moins sensibles ont été mises au point comme la technique « Enzyme-linked immunoSorbent assay » (ELISA) et la microscopie électronique qui permet de détecter la PrPsc sous forme des association de fibrilles "Scrapie associated fibrils" (SAF). On note aussi la technique de Slot Blot qui utilise les deux propriétés biochimiques de la PrPsc que sont la résistance à la digestion par la PK et l’insolubilité dans les détergents

[57]. Cette technique est basée sur le même principe que celui de

l'immunotransfert, à l'exception de l'étape de migration électrophorétique. La protéine est directement déposée sur la membrane sous forme de traits (=slot), et les étapes ultérieures sont identiques à celles employées lors de l'immunotransfert [58]. Récemment, il a été développé le Pet-Blot (Paraffin-embedded-tissue blot). Il s’agit d’une technique plus sensible pour détecter la PrPsc à partir de coupes en paraffine. Elle permet de réunir les avantages de l’IHC et du WB, à savoir, la préservation de la morphologie tissulaire et la sensibilité. [59]

II. 3. 2. Techniques de mise en évidence de mutations par l’étude du gène PRNP

L’étude du gène PRNP permet de poser un diagnostic prénatal des maladies à prions d’origine génétique, ainsi qu’un diagnostic présymptomatique dans un cadre strictement encadré. [49]

cadre d’étude rétrospectives, à partir de tissus congelés. La compacité du gène, la totalité de la séquence codante étant inclus dans l’exon 2 du gène, permet la mise en œuvre de techniques de recherche de mutation, relativement rapides, comme l’électrophorèse en gradient de dénaturants (DGGE) ou la technique du polymorphisme de conformation simple brin "single-stranded comformational polymorphism" (SSCP), après amplification de la séquence codante par PCR. La caractérisation de mutations se réalise ensuite par séquençage direct des produits d’amplification du gène. [43]

II- 3. 2.1. "Polymerase chain reaction" (PCR) [161]

Elle permet d'obtenir à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie.

 Principe

Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime (3') pointent l'une vers l'autre. Les amorces ou «primers» en anglais définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier. L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle (Fig. 14).

 Avantages [161]

- Forte sensibilité ; (100%) - Excellente spécificité ; (100%) - Rapide. (1 heure à 2 heures)

 Inconvénient

- Elle nécessite un matériel spécialisé ; - Coût élevé. ( 175€ )

II. 3. 2.2. Electrophorèse en gradient de dénaturant (DGGE) [161]

Elle permet de détecter des polymorphismes ou des mutations sur ADN.

 Principe

Les petits fragments d'ADN sont soumis à une électrophorèse dans un gel de polyacrylamide sous condition de dénaturation croissante (concentration en formamide/urée), L'ADN fond et devient simple brin. Le point auquel l’ADN fond dépend de la séquence nucléotidique dans la région en fusion. La localisation finale de la molécule dans le gel dépend de ce fait de la séquence nucléotidique des fragments (Fig. 15).

Fig. 15: Diagnostic anténatal dans le cadre d’un SGSS lié a la mutation A117V du gène PRNP porté par la mère. [43]

- Les gènes des parents et de fœtus sont amplifiés par PCR et analysé par électrophorèse sur gel dénaturent.

- Le profil de bandes chez le fœtus (F), identique à celui de père (P), indique qu’il n’est pas porteur de la mutation maternelle (M).

 Avantages

- Utilisation de l’ADN de très petite taille ; - Sensibilité élevée.

 Inconvénients

- Elle ne révèle pas la position de la mutation.

II. 3. 2.3. «single-stranded conformational polymorphism" (SSCP) [161]

La SSCP permet de distinguer deux séquences d’ADN très similaires, uniquement sur la base de la forme particulière de leurs structures simple brin, même deux allèles du même gène peuvent alors être discriminés.

 Principe

La SSCP est basée sur le comportement électrophorétique de molécules d’ADN simple brin dans un gel d’acrylamide non dénaturant. Les différences dans les conformations conduisent les brins d’ADN à migrer de façon

différentielle dans le gel.

 Avantages - Simple ;

- Matériel n’est pas cher.

 Inconvenient

- Résultas variable (conditions de température et de migration) ; - Sensibilité limitée ;

- Elle ne peut pas analyser de longs fragments d’ADN (>200 paires de bases)