Após a obtenção dos óleos essenciais da primeira e da segunda amostra de folhas, os materiais vegetais contidos nas respectivas soluções aquosas foram filtrados obtendo-se soluções aquosas límpidas (Figura 12). Cada solução aquosa obtida foi primeiro extraída com duas porções de 200 mL de CHCl3, lavando-se pelo
menos uma vez com água as fases orgânicas reunidas e secando-se com Na2SO4
anidro, concentrando-se à secura em evaporador rotativo a vácuo e calculando-se o rendimento em relação à massa do material vegetal.
Após as extrações com CHCl3, foi medido o pH das soluções aquosas
restantes em cada caso e adicionando-se solução de NaOH 6 mol/L até pH 8. As extrações foram realizadas com três porções de 200 mL com AcOEt. As fases orgânicas foram concentradas em evaporador rotativo e pesadas.
Para cada uma das amostras, a solução aquosa básica foi submetida a três extrações com porções de 200 mL de uma mistura de AcOEt/MeOH 30%, concentrando-se as fases orgânicas em evaporador rotativo.
A cada solução aquosa básica foi acidificado HCl concentrado até pH 4. No caso da primeira amostra, a solução aquosa ácida foi extraída com três porções de 200 mL da mistura de AcOEt/MeOH 30%, utilizando-se apenas AcOEt nas extrações da segunda amostra. As fases orgânicas foram reunidas e evaporadas em evaporador rotativo, obtendo-se os extratos AcOEt/MeOH 30% (primeira amostra tratada) e AcOEt (segunda amostra) em pH 4.
FIGURA 12 - Esquema de obtenção de óleos essenciais e frações orgânicas de C. hispida
Material vegetal + solução aquosa Óleo essencial
(CHOE)
Hidrodestilação 2 h e 30 min
Filtração
Extração com AcOEt Material vegetal
Extrato AcOEt, pH 8 Fenóis neutros apolares Solução aquosa básica
Extrato AcOEt/MeOH 30%, pH 8 (CHAM) Material vegetal extraído
Extração com CHCl3
Extrato CHCl3 Solução aquosa
Extração com AcOEt/MeOH 30%
Solução aquosa (CHEA)
Terpenos Solução de NaOH 6 mol L-1
Solução aquosa pH 8 Liofilizado (20 mL)
Solução aquosa, pH 4
Fenóis neutros polares Solução aquosa ácida
HCl conc.
Após a última extração com AcOEt como descrito na Figura 12, a solução aquosa ácida da segunda amostra foi submetida à extração com três porções de 200 mL da mistura de AcOEt/MeOH 30% e as fases orgânicas foram reunidas e concentradas, obtendo-se o respectivo extrato em pH 4.
Os extratos obtidos com AcOEt e com a mistura de AcOEt/MeOH 30% em pH ácido e básico foram analisados por UV-Vis na faixa de comprimentos de onda de 200 a 450 nm utilizando-se metanol como solvente e os reagentes de deslocamento AcONa, H3BO3, solução aquosa saturada de AlCl3 e de HCl 4 mol/L, e
os dados foram interpretados de acordo com a literatura (MARKHAN,1982). O fluxograma da Figura 12 representa esquematicamente o processo de obtenção do óleo essencial e em seguida dos extratos com CHCl3, AcOEt e a mistura de
AcOEt/MeOH 30% em pH 8, com AcOEt e a mistura de AcOEt/MeOH 30% em pH 4. Os extratos obtidos no fracionamento descrito acima foram analisados por CCD com uso de vários sistemas eluentes constituídos por misturas de CHCl3/MeOH (10:0; 9,9:0,1; 9,8:0,2; 9,5:0,5; 9,0:1,0) e de AcOEt/MeOH/H2O
(8,0:1,5:0,5; 7,0:2,5:0,5) sobre placas de sílica pré-preparadas. Após o desenvolvimento, os cromatogramas foram observados e registrados fotograficamente sob luz UV de 254 e 360 nm e em seguida revelados primeiro com H2SO4/MeOH (1:1) seguindo-se aquecimento sobre chapa térmica a 120 ºC por 10
minutos ou então com uma solução de FeCl3 a 5% em metanol.
Os extratos obtidos da amostra coletada em dezembro de 2012 (1ª amostra, item 7.1) com a mistura de AcOEt/MeOH 30% em pH 4 e pH 8 foram analisados por CCD utilizando sistema eluente AcOEt/MeOH/H2O (8,0:1,5:0,5) em comparação com
padrões dos ácidos 3-cafeoilquínico, 3,5-dicafeoilquínico e 4,5-dicafeoilquínico. As placas prontas foram observadas e fotografadas sob luz UV de 254 e 360 nm, reveladas com H2SO4/MeOH (1:1) e com solução metanólica de FeCl3. O extrato
obtido com a mistura de AcOEt/MeOH 30% em pH 4 apresentou uma única mancha na placa cromatográfica, substância que recebeu o código CHAM. Os espectros de RMN 1H e 13C (CD3OD), UV-Vis e IV da substância CHAM e estes são apresentados
7.4.1 Fracionamento do extrato obtido com acetato de etila em pH 4
Parte do extrato obtido com AcOEt em pH 4 conforme o esquema mostrado na Figura 12 (~1,4 g, segunda amostra) foi fracionado em coluna cromatográfica montada com 100 g de Sílica gel 60 (0,04 - 0,063 mm, 23-240 mesh ASTM) de 2,5 cm de diâmetro e 20 cm de altura. Uma suspensão de sílica foi preparada em 80 mL de uma mistura de AcOEt/MeOH/H2O (8,0:2,0:0,5). A amostra do extrato foi
dissolvida em 5 mL da mistura de solventes e a solução foi adicionada ao topo da coluna, a qual foi eluída com ~250 mL da mesma mistura de solventes com um fluxo de 5 mL min-1, coletando-se 25 frações de 10 mL cada uma. Em seguida, a polaridade do eluente foi aumentada usando-se ~300 mL de uma mistura de AcOEt/MeOH/H2O (7,0:2,5:0,5), coletando-se mais 25 frações de 10 mL. As frações
foram aplicadas sobre placas cromatográficas eluídas com AcOEt/MeOH/H2O
(8,0:2,0:0,5), visualizando-se os cromatogramas sob luz ultravioleta de 254 e 360 nm, revelando-se em seguida com H2SO4/MeOH (1:1) seguindo-se o aquecimento
em chapa térmica a 120 °C por 10 minutos. As frações que apresentaram manchas similares por CCD foram agrupadas, evaporadas e seus respectivos rendimentos foram calculados.
O composto fenólico mais polar presente no extrato bruto foi observado entre as frações 36 a 39 (Rf = 0,44, 83,5 mg, ~ 6% de rendimento em relação ao extrato) e codificado como CHA4E, apresentando-se com impurezas.
Os dados dos espectros de RMN 1H e 13C, UV-Vis e IV da substância CHA4E são mostrados nos itens 7.7.4 e 8.4, Figuras 25 e 26.